Succesfuld brug af cellesporing farvestoffer til at overvåge immun celle funktion og proliferation involverer flere kritiske trin. Vi beskriver metoder til: 1) opnåelse af lys, ensartet og reproducerbar etiket-ning med membran farvestoffer, 2) udvælgelse af fluorokromer og dataopsamling betingelser, og 3) at vælge en model til at kvantificere celleproliferation baseret på farvestof fortynding.
Fluorescerende cellesporing farvestoffer, i kombination med flow og image cytometri, er stærke redskaber til at undersøge samspillet og skæbne af forskellige celletyper in vitro og in vivo. 1-5 Selv om der er bogstaveligt talt tusindvis af publikationer ved hjælp af sådanne farvestoffer, hvoraf nogle de hyppigst forekommende celle tracking applikationer omfatter overvågning af:
Kommercielt tilgængelige cellesporing farvestoffer varierer meget i deres kemiske og fluorescensegenskaber, men størstedelen falder i en af to klasser baseret på deres den celle-mærkning. "Membrane farvestoffer", typisk kendetegnet ved PKH26, er yderst lipofile farvestoffer that partition stabilt, men ikke-covalent til cellemembraner 1,2,11. "Protein farvestoffer", typisk kendetegnet ved CFSE, er amino-reaktive farvestoffer, der danner stabile covalente bindinger med celleproteiner 4,16,18. Hver klasse har sine egne fordele og begrænsninger. Nøglen til deres succesfulde anvendelse, især i flerfarvet undersøgelser, hvor flere farvestoffer anvendes til at spore forskellige celletyper, er derfor at forstå de kritiske spørgsmål muliggør optimal udnyttelse af hver klasse 2-4,16,18,24.
De protokoller, der er medtaget her fremhæve tre almindelige årsager til dårlig eller varierende resultater, når du bruger celle-tracking farvestoffer. Disse er:
Eksemplerne her illustrerer, hvordan disse variabler kan påvirke resultaterne ved brug membran og / eller protein farvestoffer til overvågning af celleproliferation.
De metoder, der er beskrevet her, er dem, der findes i vores kombinerede laboratorier til mest pålideligt at give optimale resultater for hPBMC mærkning ved hjælp af membran farvestoffer 13,16,18 og for lymfocytdelmængde fænotypebestemmelse og spredning sporing ved hjælp af enten membran eller protein farvestoffer 2,11,13,16, 18. Som vist i figur 1 og 2, er lyse ensartet mærkning lettest opnås ved at begrænse tilstedeværelsen af fysiologiske salte og anvendelse af et blandings teknik, som resulterer i hurtig, ensartet eksponering af alle celler i den samme koncentration af farvestof. Fordi farvning med membran farvestoffer sker ved opdeling i lipiddobbeltlaget, kan andre variabler, som ændrer frit farvestof koncentration også påvirke mærkningseffekt. For eksempel mærkning i rundbundede polystyrenrør resulterer i mindre effektiv udvaskning af salte forud for resuspendering i Diluent C og også i reduceret frit farvestof koncentration på grund af farvning af adsorption på rørvæggene, isærved lavere farvestofkoncentrationer. Begge faktorer tendens til at give bredere farvning fordelinger end når mærkning udføres under anvendelse konisk bund polypropylenrør (figur 3, 4 og upublicerede resultater). Prøve alder og type kan også påvirke topbredde selv når optimerede farvningsprocedurer anvendes. For eksempel CV'er for PKH26 pos lymfocytter isoleret fra frisktappet blod spænder fra 14-20% (figur 3, ref. 13 og upublicerede resultater), mens CV'er for lymfocytter isoleret fra 24 hr gamle blodprøver eller TRIMA pheresis filtre spænder fra 25 til 30 % (figur 4 og ref. 18).
Farvning ensartethed og i hvilket omfang ikke-levedygtige celler kan udelukkes fra analysen både indflydelse på, om skelnelige afledte toppe tydelige i farvestoffet fortynding profil, som igen påvirker valget af en spredning model til at passe de observerede data (figur 5 og 6 </strong>). Selvom ModFit (Verity Software House, Topsham, ME) bruges her som et eksempel på software, der bruges til at generere parametre såsom spredning Index og Precursor frekvens (figur 3, 5 og 6, Tabel 3), andre software pakker indeholder også moduler til at analysere spredning data. Disse omfatter FCSExpress (De Novo Software, Los Angeles, CA) og FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR). Alle disse programmer bruger en ikke-lineær mindste kvadraters analyse til iterativt finde den bedst egnede til de rå data ved at ændre position, højde og SD (eller bredde) af gaussiske toppe, der repræsenterer sekventielle datter generationer. Proliferativ Index (PI) og Precursor Frequency (PF) er de mest almindeligt anvendte foranstaltninger omfang af spredning. PI, som defineret af ModFit, er et mål for stigningen i celleantallet i løbet af assayet, analogt med "stimulation index" af en thymidinoptagelsesassay. PF returnerer fraktion af celler i den oprindelige population, der reagerede på stimulus ved breder sig. Der bør udvises forsigtighed, men når man læser litteratur siden terminologi varierer noget blandt softwarepakker (f.eks FlowJo og ModFit bruger forskellige definitioner og beregninger for, hvad der menes med "spredning Index") 22.
De kritiske spørgsmål, der drøftes her for mærkning og spredning analyse med membran farvestoffer er også stødt på, når du bruger protein farvestoffer. For eksempel skal omhyggelig med blandeteknik også observeres sammen med udelukkelse af døde / døende celler, for at opnå ensartede fordelinger og skelnelige afledte toppe ved brug CFSE (fig. 6) 2-4,13,18,24. Passende valg af fluorochromer til fænotypebestemmelse og rentabilitetsvurderingen er også vigtigt at undgå for store spektral overlapning og manglende evne til at genkende antistof-positive celler, især med synlige emitterende protein farvestoffer, såsom CFSE 2-4,11,13,16,18 </sup>. Reduktion af koncentrationen af sporing farvestof nedsætter erstatning problemer i tilstødende spektrale kanaler, men også begrænser antallet af celledelinger, som kan overvåges før datter celle intensiteter begynder at overlappe med autofluorescens. Alternativt kan du bruge af nyere cellesporing farvestoffer, såsom den langt rød emitterende CellVue Claret (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) eller violet udsender CellTrace Violet (Life Technologies, Grand Island, NY) kan nedsætte erstatningen problemer (figur 6). Endelig, selv membran farvestoffer generelt tendens til at udvise mindre toksicitet 11,26, er det muligt at over-mærkning af celler med enten klasse af farvestof. Det er derfor altid nødvendigt at kontrollere, at koncentrationen af sporing anvendte farvestof ikke har ændret funktionaliteten af cellerne, der skal spores (fig. 6) 3,13,16,18.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil især gerne takke følgende personer for deres tekniske og intellektuelle bidrag til udviklingen af disse metoder gennem årene: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nadege Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis Cell Science og PTI Research) , Brian Gray (PTI Research), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice Givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc.), og Mary Waugh (Dartmouth Medical School). De vil også gerne takke Bowdoin klassen af 2006 fra de årlige Kurser i Research Methods and Applications af flowcytometri, som har frembragt de data, der er vist i figur 2.
Flowcytometri blev udført ved Roswell Park Cancer Institute Flowcytometri Laboratory, som blev etableret delvist af udstyr tilskud fra NIH Shared Instrument Program, og modtager støtte fra Core Grant (5 P30 CA016056-29) fra NationalCancer Institute til Roswell Park Cancer Institute, og på Abramson Cancer Center Flowcytometri og Celle Sortering Resource Laboratory ved University of Pennsylvania, som blev etableret delvist af udstyr tilskud fra NIH Shared Instrument Program, og modtager støtte fra NIH # 2P30 CA016520 fra National Cancer Institute. Arbejdet er vist i figur 3 og 5 blev også delvist understøttet af SBIR tilskud EB00228 fra National Institutes of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) udstedt til PTI Research, Inc.
Reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
Commercially Purchased | |||
7-Aminoactinomycin D | Sigma-Aldrich | A9400 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
Hanks balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-079 | Calcium and magnesium free, without phenol red |
Human IgG Cohn fraction II and III globulins | Sigma-Aldrich | G-4386 | |
Mouse anti-human CD3-FITC | BD Biosciences | 349201 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD4-APC | BD Biosciences | 340672 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD4-PECy7 | BD Biosciences | 348799 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD8-FITC | BD Biosciences | 347313 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD8-APC | Caltag (Life Technologies) | MHCD0805 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD19-APC | Caltag (Life Technologies) | MHCD1905 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD25-APC | BD Biosciences | 340938 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD127-PE | BD Biosciences | 557938 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD3 | eBiosciences | 16-0037-85 | 1.0 mg/ml; azide free |
Mouse anti-human CD28 | eBiosciences | 16-0289-85 | 1.0 mg/ml; azide free |
PBS | Gibco | 21300-058 | |
PKH26 red fluorescent cell linker kit containing 10-3M PKH26 in EtOH and Diluent C | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT or MINI26-1KT |
Procedures in Step 1 also apply to kits containing PKH67 or other CellVue dyes |
CellVue Claret far red fluorescent cell linker kit containing 10-3M CellVue Claret in EtOH and Diluent C | Sigma-Aldrich | MINCLARET-1KT or MIDCLARET-1KT | |
5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester (CFDA-SE) | Invitrogen (Life Technologies) | C34554 | Non-fluorescent; cleaved by membrane esterases to form fluorescent amino-reactive carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) |
LIVE/DEAD Fixable Violet | Invitrogen (Life Technologies) | L34955 | |
Sterile 12 x 75 mm conical polypropylene tubes & caps |
VWR | 60818-102 | Gives better membrane dye staining efficiency (reduced dye adsorption; less cell loss during supernatant aspiration) |
12 x 75 mm round bottom polystyrene tubes |
Becton Dickinson | 21008-936 | |
Flow cytometer | BD Bioscience | FACSCalibur LSRFortessa |
Any cytometer able to detect FITC, PKH26, and 7-AAD (ex. 488 nm; em. 520 nm, 567 nm, and 655 nm, respectively) and APC ex. 633-640 nm; em. 660 nm) |
Flow cytometer | Beckman Coulter | LSRII CyAn | Any cytometer able to detect FITC, PKH26, and 7-AAD (ex. 488 nm; em. 520 nm, 567 nm, and 655 nm, respectively) and APC ex. 633-640 nm; em. 660 nm) |
Laboratory Prepared | |||
7-Aminoactinomycin D, concentrated stock |
NA | NA | 1 mg/ml in PBS. Freeze in aliquots and store at -20 °C. |
7-Aminoactinomycin D, working stock |
NA | NA | 100 μg/ml in PBS; prepare daily from 1 mg/ml frozen stock. |
IgG block | NA | NA | HBSS + 10 mg/ml Human IgG Cohn fraction II and III globulins + 10 mg/ml BSA. |