सेल ट्रैकिंग रंगों के सफल उपयोग करने के लिए प्रतिरक्षा सेल समारोह और प्रसार पर नजर रखने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम शामिल है. हम के लिए विधियों का वर्णन: 1) उज्ज्वल, वर्दी, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य झिल्ली रंगों के साथ लेबल आईएनजी प्राप्त करने, 2) fluorochromes और डाटा अधिग्रहण शर्तों का चयन, और 3) के लिए सेल डाई कमजोर पड़ने के आधार पर प्रसार यों के लिए एक मॉडल का चयन.
Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. “Membrane dyes”, typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. “Protein dyes”, typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.
यहाँ वर्णित तरीकों हमारे संयुक्त प्रयोगशालाओं में पाया गया सबसे hPBMC 13,16,18 झिल्ली रंगों का उपयोग कर लेबलिंग के लिए और लिम्फोसाइट सबसेट phenotyping और प्रसार ट्रैकिंग या झिल्ली या प्रोटीन 2,11,13,16 रंगों का उपयोग करने के लिए मज़बूती से इष्टतम परिणाम दे रहे हैं, 18. आंकड़े 1 और 2 में सचित्र, उज्ज्वल वर्दी लेबलिंग सबसे आसानी से लवण की शारीरिक उपस्थिति सीमित है और एक मिश्रण तकनीक का उपयोग कर से प्राप्त है कि तेजी से, सभी कोशिकाओं के सजातीय डाई उसी की एकाग्रता के लिए जोखिम में परिणाम. क्योंकि झिल्ली रंगों के साथ धुंधला लिपिड bilayer में विभाजन होता है, तो अन्य चर है कि मुक्त डाई एकाग्रता में परिवर्तन भी लेबलिंग दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, लवण की कम कुशल वार्शआउट में तनुकारक (वस्तु) सी में resuspension पहले दौर नीचे polystyrene ट्यूबों परिणामों में लेबलिंग और भी कम मुक्त डाई ट्यूब दीवारों पर सोखना डाई करने के लिए, विशेष रूप से की वजह से एकाग्रता मेंकम डाई सांद्रता में. दोनों कारकों के लिए व्यापक जब लेबलिंग किया जाता है से धुंधला हो जाना वितरण शंक्वाकार नीचे polypropylene ट्यूब (3 आंकड़े, 4 और का उपयोग कर दे देते हैं अप्रकाशित परिणाम). नमूना उम्र और प्रकार भी शिखर चौड़ाई को प्रभावित कर सकते हैं जब भी अनुकूलित धुंधला हो जाना प्रक्रियाओं का इस्तेमाल किया जाता है. उदाहरण के लिए, हौसले से तैयार की 14-20% से रक्त जबकि 24 घंटे पुराने रक्त नमूनों या TRIMA pheresis फिल्टर रेंज से अलग लिम्फोसाइटों के लिए सीवी (3 चित्रा, रेफरी 13. और अप्रकाशित परिणाम) सीमा से अलग PKH26 स्थिति लिम्फोसाइटों के लिए सीवी 25-30 से % (4 चित्रा और रेफरी 18.).
एकरूपता और हद तक जो अलाभकारी कोशिकाओं विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है दोनों को प्रभावित कि वर्गो में विभाजनीय बेटी चोटियों डाई कमजोर पड़ने प्रोफाइल, जो बारी में एक प्रसार मॉडल की पसंद को प्रभावित करने के लिए मनाया डेटा (5 और 6 आंकड़े फिट में स्पष्ट कर रहे हैं धुंधला </strong>). हालांकि ModFit (सत्य सॉफ्टवेयर हाउस, Topsham, इ) यहाँ प्रसार सूचकांक और अग्रदूत आवृत्ति (आंकड़े 3, 5 और 6, 3 टेबल) जैसी मीट्रिक उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर के एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है, अन्य सॉफ्टवेयर संकुल भी मॉड्यूल का विश्लेषण करने के लिए होते हैं प्रसार डेटा. ये शामिल FCSExpress (डी नोवो सॉफ्टवेयर, लॉस एंजिल्स, CA) और FlowJo (ट्री स्टार, इंक, Ashland, या). इन कार्यक्रमों के सभी एक गैर रेखीय कम से कम वर्ग विश्लेषण का उपयोग करने iteratively स्थिति, ऊंचाई और गाऊसी अनुक्रमिक बेटी पीढ़ियों का प्रतिनिधित्व चोटियों की एसडी (या चौड़ाई) को बदलने से कच्चे डेटा के लिए सबसे अच्छा फिट खोजने. Proliferative (पीआई) सूचकांक और अग्रदूत आवृत्ति (पीएफ) के प्रसार की हद तक का सबसे अधिक इस्तेमाल किया उपाय कर रहे हैं. PI, रूप में ModFit द्वारा परिभाषित किया गया है, परख के दौरान सेल की संख्या में वृद्धि, एक thymidine तेज परख 'उत्तेजना सूचकांक' अनुरूप का एक उपाय है. पीएफ रिटर्न प्रारंभिक populat में कोशिकाओं के अंशआयन है कि proliferating द्वारा प्रोत्साहन के लिए प्रतिक्रिया व्यक्त की. सावधानी की सलाह दी है, लेकिन, जब साहित्य पढ़ने के बाद से शब्दावली कुछ सॉफ्टवेयर (जैसे, FlowJo और ModFit द्वारा "प्रसार सूचकांक" क्या मतलब है के लिए अलग परिभाषाओं और गणना का उपयोग) संकुल के बीच 22 से भिन्न होता है.
झिल्ली रंगों के साथ प्रसार विश्लेषण और लेबलिंग के लिए महत्वपूर्ण मुद्दों पर चर्चा भी जब प्रोटीन रंगों का उपयोग कर सामना कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, मिश्रण तकनीक के लिए सावधान ध्यान भी मृत / मर कोशिकाओं का बहिष्कार के साथ मनाया जाना चाहिए, क्रम में वर्दी वितरण और वर्गो में विभाजनीय बेटी चोटियों को प्राप्त करने के लिए जब (6 चित्रा) CFSE 2-4,13,18,24 का उपयोग कर. Phenotyping और व्यवहार्यता के मूल्यांकन के लिए fluorochromes का उपयुक्त विकल्प भी महत्वपूर्ण है अत्यधिक वर्णक्रमीय ओवरलैप और एंटीबॉडी पॉजिटिव कोशिकाओं की पहचान करने में असमर्थता से बचने दिखाई उत्सर्जन प्रोटीन ऐसे 2-4,11,13,16,18 CFSE के रूप में रंगों के साथ विशेष रूप से, </sup>. ट्रैकिंग डाई की एकाग्रता को कम आसन्न वर्णक्रमीय चैनलों में मुआवजे की समस्याओं को कम हो जाती है, लेकिन यह भी नजर रखी जा सकता है कि सेल डिवीजनों की संख्या की सीमा से पहले बेटी सेल तीव्रता autofluorescence साथ ओवरलैप शुरू. वैकल्पिक रूप से उपयोग करते हैं, दूर लाल उत्सर्जन CellVue (सिग्मा Aldrich, सेंट लुइस, MO) क्लैरट या बैंगनी उत्सर्जक CellTrace वायलेट (जीवन टेक्नोलॉजीज, ग्रांड द्वीप, NY) के रूप में इस तरह के नए सेल ट्रैकिंग रंगों के मुआवजे की समस्याओं को कम कर सकते हैं (चित्रा 6). अंत में, हालांकि झिल्ली रंजक आम तौर पर कम 11,26 विषाक्तता का प्रदर्शन करते हैं, यह डाई के दोनों वर्ग के साथ लेबल की कोशिकाओं के लिए संभव है. इसलिए यह हमेशा सत्यापित करने के लिए आवश्यक है कि ट्रैकिंग डाई का इस्तेमाल किया एकाग्रता कोशिकाओं की कार्यक्षमता का पता लगाया जा (6 चित्रा) 3,13,16,18 नहीं बदल दिया गया है.
The authors have nothing to disclose.
The authors would particularly like to thank the following individuals for their technical and intellectual contributions to the development of these methods through the years: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nadège Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis Cell Science and PTI Research), Brian Gray (PTI Research), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice Givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc.), and Mary Waugh (Dartmouth Medical School). They would also like to thank the Bowdoin class of 2006 from the Annual Courses in Research Methods and Applications of Flow Cytometry, which generated the data shown in Figure 2.
Flow cytometry was performed at Roswell Park Cancer Institute’s Flow Cytometry Laboratory, which was established in part by equipment grants from the NIH Shared Instrument Program, and receives support from the Core Grant (5 P30 CA016056-29) from the National Cancer Institute to the Roswell Park Cancer Institute, and at the Abramson Cancer Center Flow Cytometry and Cell Sorting Resource Laboratory of the University of Pennsylvania, which was established in part by equipment grants from the NIH Shared Instrument Program, and receives support from NIH #2P30 CA016520 from the National Cancer Institute. The work shown in Figures 3 and 5 was also supported in part by SBIR grant EB00228 from the National Institutes of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) awarded to PTI Research, Inc.
Reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
Commercially Purchased | |||
7-Aminoactinomycin D | Sigma-Aldrich | A9400 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
Hanks balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-079 | Calcium and magnesium free, without phenol red |
Human IgG Cohn fraction II and III globulins | Sigma-Aldrich | G-4386 | |
Mouse anti-human CD3-FITC | BD Biosciences | 349201 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD4-APC | BD Biosciences | 340672 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD4-PECy7 | BD Biosciences | 348799 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD8-FITC | BD Biosciences | 347313 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD8-APC | Caltag (Life Technologies) | MHCD0805 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD19-APC | Caltag (Life Technologies) | MHCD1905 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD25-APC | BD Biosciences | 340938 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD127-PE | BD Biosciences | 557938 | Saturating concentration as determined by laboratory titration |
Mouse anti-human CD3 | eBiosciences | 16-0037-85 | 1.0 mg/ml; azide free |
Mouse anti-human CD28 | eBiosciences | 16-0289-85 | 1.0 mg/ml; azide free |
PBS | Gibco | 21300-058 | |
PKH26 red fluorescent cell linker kit containing 10-3M PKH26 in EtOH and Diluent C | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT or MINI26-1KT |
Procedures in Step 1 also apply to kits containing PKH67 or other CellVue dyes |
CellVue Claret far red fluorescent cell linker kit containing 10-3M CellVue Claret in EtOH and Diluent C | Sigma-Aldrich | MINCLARET-1KT or MIDCLARET-1KT | |
5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester (CFDA-SE) | Invitrogen (Life Technologies) | C34554 | Non-fluorescent; cleaved by membrane esterases to form fluorescent amino-reactive carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) |
LIVE/DEAD Fixable Violet | Invitrogen (Life Technologies) | L34955 | |
Sterile 12 x 75 mm conical polypropylene tubes & caps |
VWR | 60818-102 | Gives better membrane dye staining efficiency (reduced dye adsorption; less cell loss during supernatant aspiration) |
12 x 75 mm round bottom polystyrene tubes |
Becton Dickinson | 21008-936 | |
Flow cytometer | BD Bioscience | FACSCalibur LSRFortessa |
Any cytometer able to detect FITC, PKH26, and 7-AAD (ex. 488 nm; em. 520 nm, 567 nm, and 655 nm, respectively) and APC ex. 633-640 nm; em. 660 nm) |
Flow cytometer | Beckman Coulter | LSRII CyAn | Any cytometer able to detect FITC, PKH26, and 7-AAD (ex. 488 nm; em. 520 nm, 567 nm, and 655 nm, respectively) and APC ex. 633-640 nm; em. 660 nm) |
Laboratory Prepared | |||
7-Aminoactinomycin D, concentrated stock |
NA | NA | 1 mg/ml in PBS. Freeze in aliquots and store at -20 °C. |
7-Aminoactinomycin D, working stock |
NA | NA | 100 μg/ml in PBS; prepare daily from 1 mg/ml frozen stock. |
IgG block | NA | NA | HBSS + 10 mg/ml Human IgG Cohn fraction II and III globulins + 10 mg/ml BSA. |