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Biology

コナジラミを使用した送信植物ウイルス

doi: 10.3791/4332 Published: November 8, 2013

Summary

の我々の理解と昆虫透過植物ウイルスの多くを管理する当社の能力を改善することは、ベクトルを使用する必要があります。植物ウイルスの昆虫送信がtritrophic相互作用であり、そのようなものとして昆虫、ウイルス、プラントの操作を必要とする。ベクターは、大量に飼育や植物をテストするために、伝送率の高さを確保するような方法で操作する必要があります。コナジラミを飼育し、操作の基本、

Abstract

コナジラミ、 半翅目:コナジラミ、タバココナジラミ 、形態学的にindistinquishable種5の複合体は、多くの植物ウイルスのベクトルである。これらのコナジラミ-透過植物ウイルス(Begomovirus、Carlavirus、Crinivirus、Ipomovirus、Torradovirus)のいくつかの属には、重要な食料と繊維作物の新興国や経済的に重要な病原体(9,10,16によって審査)の数百種を含む。これらのウイルスは、そのベクトルには複製されませんが、それにもかかわらず、様々な手段(2,6,7,9,10,11,17によって審査)で大人のコナジラミによって工場から工場へ容易に移動されます。他の人が唯一のプロービングに必要とされている間、これらのウイルスのほとんどコナジラミ供給は、取得及び接種が必要です。これらのウイルスの多くが容易にできない場合、または他の手段によって送信することができない。ウイルス培養、生物学的および分子特性(宿主範囲や症状の識別)3,13のよってメンテナンス、生態2,12は 、ウイルスがコナジラミベクトルを用いた実験のホストに送信されている必要があります。さらに、新たな化学物質14又は化合物15、新たな文化的アプローチ1,4,19の評価、あるいは抵抗性品種7,8,18の選定や開発などの管理への新しいアプローチの開発は、、のためのコナジラミを使用する必要がありますウイルス感染。選択と育種プログラムにおける抵抗性品種の開発のための植物ウイルスのコナジラミトランスミッションの使用は特に7に挑戦ている。抵抗のための効果的な選択およびスクリーニングは、植物の多数を採用し、抵抗性遺伝子を有するいくつかの遺伝子型を検出するために接種する植物の100%が必要である。これらの研究は、多くの場合、病原体を持つコナジラミ、年間数回の大規模な番号を使用します。

コナジラミのメンテナンスはここで説明され、数百または数千を生成することができます植物に成人コナジラミ毎週、年間を通して、他の植物ウイルスの汚染なし。コナジラミとウイルスの両方の自由植物は毎週コナジラミ植民地に導入するために生産されている必要があります。コナジラミ培養はコナジラミ病原菌、寄生虫、およびコナジラミ個体数を減らすこと、および/またはウイルスの伝達効率を減らすことができる寄生の自由保たれなければならない。記載された方法で製造コロニーを迅速に、必要に応じて個体数を増減するようにスケーリングすることができ、ウイルスの植物宿主に基づくコナジラミの摂食嗜好に適応するように調整することができる。

nonviruliferousと病原体を持つコナジラミのコロニー:維持できるコナジラミのコロニーの2つの基本タイプがあります。 nonviruliferousコロニーは、ウイルスフリーの植物で飼育コナジラミで構成されており、異なる文化からウイルスを送信するために使用することができますコナジラミの毎週の可用性を可能にする。病原体を持つコナジラミコロニー、ウイルスに感染した植物で飼育コナジラミ成る、ウイルス送信プロセスの1つのステップを省くため、ウイルスを獲得したコナジラミの毎週の可用性を可能にします。

Protocol

1。コナジラミコロニーのメンテナンス

  1. 環境条件:コナジラミコロニーを制御成長室で維持されるべきである。相対湿度、温度、光周期、および光強度の制御は、最適なコロニー増殖( 図1)に必須である。 28℃の温度、30〜50%相対湿度、および14時間光周期が18日で羽化(今回は植​​物宿主によって異なります)に卵から開発してコロニーが得られます。相対湿度は、昆虫や植物の真菌病原体の増殖を阻止するために70%以下に維持されるべきである。肥料率と水やりは真菌病原体と塩の蓄積を阻止するために小さくしなければならない。コロニーのための光強度はかなり高くなければならない。キャノピーの高さで約800〜1,000フィートキャンドルを生成するのに十分な数で使用するVHO蛍光灯( すなわち 。綿、インゲンマメ、ライマメ、トマト)ほとんどの植物に適しています。清潔さは不可欠である最適な飼育条件を維持するためにコナジラミコロニー。
  2. コロニーケージ:コナジラミはなく成長部屋に無料ではなく、ケージの中で植物に維持されるべきである。ケージは様々な材料で構成することができますが、考慮しなければなりません:換気、アクセスのしやすさ、必要とされるコナジラミ個体群を生成するのに十分な植物を維持するために、コナジラミエスケープまたは浸潤し、十分なサイズのを防止する機能。良好な結果がオーガンザプラスアルミスクリーニング(強度)と同様コナジラミ防スクリーニング(特定の機器および消耗品の表を参照)で得られた。
  3. コロニープラント準備:コナジラミコロニーを開始するときに選択した植物の種が重要な考慮事項です。工場は崩壊せずに高い昆虫の人口を支えることができるはずです。 nonviruliferousコロニーのために選択された工場は、植民地の汚染を避けるために送信されるように意図されたとviruliを維持している場合、ウイルスやウイルスのための非宿主であるべきferousコロニー、それがウイルスの宿主であることが必要です。植物は植民地に導入されたの18日以内に、新成人の出現をサポートするために、かなり迅速に成長する必要がありますが、それほど早く4週間以内にケージを脱却する。彼らはしばしば背品種と同様の葉面積を生成するが、茎の伸長せずにドワーフ、ブッシュ、またはパティオ型植物品種をお勧めします。
  4. コナジラミや他の昆虫を除外ケージ内温室で植民地のためにリア植物に非常に重要です。彼らは植民地に入る前にコナジラミ、アザミウマ、またはダニがはびこっている植物の使用は、コロニーが崩壊する可能性があります。寄生植物はまた、ウイルス感染の調査を妨害する昆虫が媒介するウイルスに感染する可能性を持っている。

2。コナジラミコロニー設立

  1. クリーンコナジラミを使用して初めてコロニーを開始 - 植物ウイルス、他の昆虫や昆虫病原体の無料のものを。これらを得ることができる共同研究者から、またはフィールドから。フィールドが収集した場合、コナジラミは、植物ウイルスの非宿主植物に少なくとも8週間飼育し、それらが植物ウイルスの自由であることを確認するため、プラントの症状の有無を確認するべきである。
  2. 週1:植物の最初のケージにきれいなコナジラミを紹介。コナジラミは、既知数の吸引によって、またはそっとコロニーへの要求に応じて、別のソース工場からコナジラミを振ることにより導入することができる。 1週の間に、コナジラミは、植物の葉の表面の下側に卵を産卵している。おおよその人口規模は、卵を産むために使用、大人の人数と、問題の宿主植物のメスコナジラミによる産卵数の平均値に基づいて、それぞれの出現のために予測することができる。
  3. 2週目:卵を産むために、新しい宿主植物にコナジラミを導入することにより、別のケージを開始します。週1で起動しケージ内の植物は卵、葉の裏側( 図2)をカバーするいくつかの未熟コナジラミを持つことになります。いくつかの1週の間に導入成人コナジラミはまだ生きているでしょう。
  4. 週3:卵を産むために新しい植物にコナジラミを導入することにより、第三のケージを開始します。週1で起動しケージ内の植物が未熟なだけでなく、新興多くの新成人のコナジラミになり、成人コナジラミ人口の非常に顕著な増加があるはずです。週2で始まっケージ内の植物は葉の裏側をカバーする多くの卵や未熟コナジラミを持つことになります。
  5. 週4:卵を産むために新しい植物にコナジラミを導入することにより、第四のケージを開始します。週1で起動しケージ内の植物は約一週間後の出現であり、多くの大人のコナジラミを持つことになります。週2で始まっケージ内の植物は新興多くの新しい成人コナジラミを持つことになりますし、コナジラミ人口の非常に顕著な増加があるはずです。 3週の間に開始したケージ内の植物は葉の裏側をカバーする多くの卵や未熟コナジラミを持つことになります。
  6. 最初の4おしっこの後毎週KS:毎週、新しい、きれいなケージに新工場に第四の最古のケージ(ケージは週1で起動し)から成人コナジラミを導入することにより、新しいケージを開始。古いケージは削除され、その植物は破棄されるべきである。これらのコナジラミは、約1週間後に出現しています。病原体を持つ植民地の場合、これらのコナジラミは、新工場にウイルスを送信するだけでなく、コナジラミ次世代の卵を産む。
  7. 第3週のケージの中に出てくるコナジラミを使用する伝送実験を計画します。よりコナジラミが必要な場合は、植物の数字を大きくすることができ、よりコナジラミはコナジラミの集団を増加させるために1週間保持器に添加することができる。

3。試験植物の接種のための方法

  1. 高い伝送速度を保証するには:1)コナジラミは、伝送速度が低下します昆虫の損傷を防ぐために、静かに、可能な限り処理しなければなりません、2)EITするコナジラミに利用可能十分な葉面積が存在する必要があります彼女のプローブまたはフィード。取得時刻又は取得宿主植物の数の増加の増加は、取得又は接種アクセス期間のいずれかで混雑による試験植物に感染性の低い率を高めることができる。
  2. コナジラミのコレクション。以下は、実験目的のために必要コナジラミの正確な数字の集合や移動するための手順です。例えば抵抗スクリーニングのために必要とされるようにコナジラミの大規模な番号を移動するには、それは静かに試験植物やウイルスに感染した買収ホスト(およびそれ以降試験植物)にわたってコナジラミが出没する植物を振ることだけが必要である。集約効果を最小限にするために多くの場所を介して植物を振るようにしてください。
  3. 新たに浮上して成人コナジラミは、(1-3日後に出現)高活性であり、それほど頻繁に餌最高伝送速度4を与える傾向にある。古いコナジラミはまだ低い周波数で送信するけど。テストプラントごとに複数のコナジラミ(PLA当たり15-40NTは)プラント当たりコナジラミ1の比が伝送率の高さのために使用されるべきでは、多くの場合、許容できないほど低い伝送レート3,4をもたらす。数が取得及び試験植物のウイルスや種依存が必要でした。
  4. 吸引デバイスとコレクションバイアルを組み立てます。 ( 図3)
  5. 片手で、コナジラミを収集することができるように含まれているコロニーケージの内側に黄色のプラスチック製のカードを保持します。優しく大人コナジラミが飛ぶことを奨励する植物をタップします。コナジラミはイエローカードに魅了され、彼らはアスピレーター、非常に穏やかな息を使って収集することができるカードに植物から飛びます。植物を食べているコナジラミを吸引しないでください。給餌ので植物は彼らのスタイレットを破るでしょうそれらをオフに引っ張ってくるとのどちらかを取得または( 図4)ウイルスを送信することが、彼 ​​らができないレンダリングながらスタイレットは、プラント内に埋め込 ​​まれている。
  6. シングルコッレに約20成人コナジラミを収集繰り返さ抱負( 図5)から、昆虫に物理的な損傷を最小限に抑えるためctionバイアル。
  7. コナジラミはタッピングから混乱している間、コレクションバイアルを変更するには、静かにパラフィルムで硬い表面とキャップでバイアルをタップします。
  8. アスピレーターに新しい収集バイアルを入れ、必要コナジラミの数が収集されるまで繰り返します。コナジラミは、数時間室温で回収バイアル中に残ることができる。
  9. 買収。コナジラミは、ウイルスに感染した植物の上に置き、48〜72時間のために感染した植物に供給するために許可されています。 72時間よりも長く取得期間は、一般的に伝送速度を増加させない。それぞれ読み取り専用またはsemipersistentようにして、1時間、数時間で送信これらのウイルスについては、十分な捕捉アクセス期間( 表1)である。コナジラミは、単一の植物や昆虫にを閉じ込める檻の植物への自由なアクセスを与えられているときに最良の結果が得られます複数の工場。しかし、いくつかの実験は、クリップケージを使用することができる場合には、特定の葉からの取得を要求する。クリップケージを使用する場合には、葉の裏側のためのコナジラミ餌の好みに対応することが重要です。また、クリップケージにコナジラミの混雑と、伝送速度を減らすことができます - 送信の許容率は、直径2.5cmのクリップケージあたり10女性コナジラミを使用して達成されている。
  10. 接種。接種のサイズに適したケージを準備し、内部試験植物を配置。唯一つの植物を接種する場合は単一の植物ケージを検討してください。複数の植物が小さいPVCフレーム/オーガンザバッグケージまたはアルミニウムケージ( 図6)を考慮接種する場合。接種に使用されるケージのサイズは、接種される植物(複数可)の大きさも若干大きくなければならない。コナジラミが近い植物キャノピーに保たれ、空き容量の多くを与えられていないときに、より高い伝送速度が得られる。
  11. 買収ホストからコナジラミの収集実験のニーズによって異なります。小さな数字が必要な場合は、上記のようにコナジラミを吸引。工場の近くにケージの中にコナジラミのコレクションバイアルを置き、蓋( 図7)を取り外します。バイアルを開き、コナジラミを離したり、反転させ、穏やかにコナジラミを解放するためにバイアルをタップします。大きな数字が必要な場合は、単に試験植物が配置されているケージにコナジラミと取得工場を移動し、優しく取得宿主植物からコナジラミを振る。導入の両方のタイプの場合は、集約を最小限に抑え、均一な接種を保証するために、植物全体でコナジラミを配布するようにしてください。
  12. コナジラミがウイルスに再び依存し、適切な時間のためのプローブまたは供給することを許可するとある程度宿主植物( 表1)。
  13. あることコナジラミを保証するために接種アクセス期間中に少なくとも一度コナジラミをチェックケージを開き、それぞれの植物にいくつかの葉を上に回して、プローブまたは給餌。
  14. 長い接種アクセス期間に、植物の上部を磨いて、植物に再配布するコナジラミを奨励するために(竹の棒または同等を使用して)静かに植物を乱す。コナジラミの再配布は、集計にコナジラミの自然な傾向に対抗することによって、より高い伝送速度を確保するのに役立ちます。
  15. 終了は。接種アクセス期間は承認の化学物質とコナジラミを殺すことによって終了します。接触殺虫剤素早く次の週との接触殺虫剤( 図8)で逃したもので開発任意のコナジラミを終了するために、成人コナジラミおよび全身殺虫剤を終了する:2殺虫相次いを適用します。このような殺虫石鹸などイミダクロプリドやピメトロジンなどの全身殺虫剤として接触殺虫剤は、良好な成功を収めて使用されている。

Representative Results

植物ウイルスを送信するためにこれらのコナジラミコロニーの確立と維持のための方法と同様に、操作は研究4,11,12,14と同様に引用していない他の多くの数で正常に使用されている。永続的に送信されるウイルスで、これらのメソッドを使用して、我々は日常的に伝送に干渉する能力(と抵抗誘導化合物の評価)13,14,17,18(のために殺虫剤をスクリーニングする、抵抗のための選択のために100%の透過率の望ましい速度を得ている図9)。ここで説明する手順は、公共および民間の研究施設で、多くの場所に適合させることができるようにしました。

伝送の種類 アクイジション·アクセス期間(時間) 接種アクセス期間(時間) REF。
非永続 1 2-24 10
Semipersistent 6-24 8-24 10、16
永続的な 48-72 48-72 図3、図6、図8、図9

表1。そのベクトルタバココナジラミ錯体。所要時間との関係の異なる種類のウイルスの透過率が高い製造することができる推定時間は、80から100までパーセント伝送に必要ないくつかのケースで修正された公表最小時間に基づいてい潜伏期間とコナジラミ個体、ウイルス、および宿主植物間の違いを考慮し。

図1
図1。病原体を持つコナジラミコロニーの例。この成長室がbegomovirusとINFEに感染した植物のケージが含まれています病原体を持つのコナジラミとSTED。

図2
図2。左:コナジラミの幼虫の段階で、 タバココナジラミ MEAMクレード扇子デバロー6約1週間後に出現し、右:大人コナジラミ、多くの植物ウイルスの効果的なベクトル。

図3
図3。植物ウイルスの送信のためのコナジラミを収集するために使用することができる収集装置のタイプ。

図4
図4。左:コレクションの準備がコナジラミを示すコナジラミ大人を収集するために使用される黄色のプラスチック製のカード 。右:黄色のプラスチック製のカードからコナジラミの収集。コナジラミは、小さな白い/灰色の斑点のようにカードで見ることができます。

図5
図5。コナジラミは、買収または接種のどちらかの準備がコロニーから(バイアル中20)吸引によって収集。

図6
図6。左上:取得または接種のどちらかのために使用される単一の植物ケージ右上:PVCパイプとオーガンジーで作られた大きなケージ。下段:コナジラミコロニーのために意図された温室含む植物におけるアルミニウム/画面とオーガンジーケージ。

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図7。コナジラミは、接種のために単一の植物(または取得)に転送される。

図8
図8。全身殺虫剤の添加は、水薬コナジラミ接種アクセス期間を終了する。

図9
図9。 トマト黄化葉巻ウイルスに対する抵抗性の評価の下のフィールド工場。すべての植物は5週齢の苗として接種した後、評価のためのフィールドに移植した。前景の植物が抵抗性遺伝資源のラインですが、バックグラウンドで植物は感受性の遺伝資源のラインです。

Discussion

ここで説明する方法は、二十年にわたって開発され、コナジラミトランスミッション、動作、および生物学の多くの研究が提供する基本的な情報に基づいています。多くの出版物があるので、この原稿はこの技術を開発するために使用されるデータの種類を説明するためにレビューすると、いくつかの選択された特定の出版物に主として指す。それはコナジラミが脚とアンテナの破壊以来、優しく扱われることを、この手順では非常に重要なのは、異常行動と伝送率の低下につながることができます。掃除機やその他の機械的な吸引装置を持つコレクションは、良い結果をもたらしませんでした。成功のための別の考慮事項は、試験植物〜100%の透過率を得るために使用コナジラミの数は、植物宿主とウイルスの組み合わせごとに決定されなければならないということである。この最適比は、一度確立される必要がある。最良の結果は、それらグラム以来、若い成人コナジラミを(1-3日過去の出現)を使用して得られている伝送の最高速度をアイブ。高齢者を用いることができるがコナジラミの大きい番号が送信それらの低減率を補償するために必要とされる。女性は、彼らがより頻繁に男性よりも養うことから、男性よりも高いレートで伝送することが知られている。しかしそれは、通常、送信のために男女を分離するための時間価値はありません。この手順は、研究者のリソースやニーズに合わせて多くの方法で変更することができる。

複数のウイルスを扱うときには、ウイルスの非宿主植物で飼育コナジラミの単一コロニーを維持するのが最善です。これらコナジラミは、取得するためのウイルスに感染した植物に置か収集することができ、次いで、取得した後、コナジラミを試験植物に再度移動させることができる。コロニーのために意図された植物は別のウイルスに感染させる可能性があり、それらをコナジラミの導入を防ぐために、ケージに温室で栽培されるべきである。ダニ、アザミウマ、および他の植物の害虫とのこれらの植物の寄生は、Hが損なわれる可能性がコロニーのealth、それが崩壊する原因となります。ついにコロニー植物の水やりには注意して行う必要があります。これらの植物は非常に多くのコナジラミと、通常よりも低い光条件の給餌によって極度のストレスにさらされています。植物は一度でもoverwateredいる場合養ミックスで泥炭に導入されているルート腐朽菌が問題になることができます。殺菌剤水薬と植物の前処理は、問題のいくつかを排除することができます。

植物ウイルスのコナジラミ送信は時間がかかり、貴重なリソース(成長室など)を必要とすることができますが、それは我々が送信の他の手段を持たないようないくつかのウイルスの伝達のために不可欠です。それはフィールド内の植物をレジストすることが期待されることが変速機の同じ型を使用するとしても、ウイルスに耐性のスクリーニング植物の貴重な手段である。トランスミッションのより人工的な手段の使用は常にヴィルための遺伝資源の評価において最高の結果を生むとは限らないS-抵抗。

Disclosures

利害の衝突は宣言されていない。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the Item Company Catalogue No. Comments (optional)
Whitefly proof screening Klayman Meteor Ltd. Petah Tikva 49130, Israel --- BioNet 50 mesh screen Antivirus Insect Screen
Whitefly proof screening Hummert International (www.hummert.com) 27-4050-1 - 27-4062-1 BioNet 50 mesh screen Antivirus Insect Screen
Whitefly Collection Devices BioQuip 1135A Can also be made using eye droppers, flexible plastic tubing, plastic vacuum adaptors, and cheesecloth
Collection vials BioQuip 8909 Vials used depend on which aspirator is used.
Yellow plastic cards any company --- Any bright yellow plastic card will work, can be purchased in many places.
Whitefly Cages --- --- These are not commercially available and must be constructed. 60 cm x 60 cm x 60 cm cages work well for us. Our preference is for those constructed of aluminum window screening, nylon organdy, vinyl plastic, with a structure created using aluminum window frames. Doors are attached using piano hinges and sealed with weather stripping; tops of the cages are vinyl plastic. Cages can also be made of 1) plexiglass glued together on the edges with ventilation provided by screened openings cut on the side pieces; 2) large bags of nylon organdy, organza, or 50 mesh whitefly screening with internal supports provided by PVC pipes and fittings cut to desired lengths and assembled inside the bags, 3) wood frames and nylon organdy, organza, or 50 mesh whitefly screening.

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References

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コナジラミを使用した送信植物ウイルス
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