Iontophoresis av nevrale agonister og antagonister under ekstracellulære<em> In vivo</em> Opptak er en effektiv måte å manipulere en nevronets mikromiljø. Disse manipulasjoner kan lettest gjøres via grisen tilbake multibarrel elektroder. Her beskriver vi hvordan å produsere dem og bruke dem under auditive opptak.
In vivo opptak fra enkle nevroner tillate en undersøker for å undersøke egenskapene til avfyring nevroner, for eksempel som svar på sensoriske stimuli. Nevroner får vanligvis flere eksitatoriske og hemmende afferente og / eller efferent innganger som integreres med hverandre, og de endelige målt respons egenskaper nervecellen er drevet av de nevrale integrasjoner av disse inngangene. Å studere informasjonsbehandling i neural systemer, er det nødvendig å forstå de forskjellige innganger til en nevron eller nevrale system, og de spesifikke egenskaper av disse innganger. En kraftig og teknisk relativt enkel metode for å vurdere den funksjonelle rolle visse innganger som en gitt nevron mottar er å dynamisk og reversibelt undertrykke eller eliminere disse innganger, og måle endringene i nevronets effekten forårsaket av denne manipulering. Dette kan gjøres ved farmakologisk endre nervecellen umiddelbare miljø med grisen tilbake multibarrel elektroder. Disse elektroder består av en enkelt tønne innspilling elektrode og en multibarrel medikament elektrode som kan bære opptil 4 forskjellige synaptiske agonister eller antagonister. De farmakologiske midler kan påføres iontophoretically på ønskede ganger under forsøket, noe som åpner for tidsstyrt produksjonstid og reversibel rekonfigurering av synaptiske innganger. Som sådan, farmakologisk manipulering av mikromiljøet representerer en kraftig og enestående metode for å teste bestemte hypoteser om nevrale krets funksjon.
Her beskriver vi hvordan grisen tilbake elektrodene er produsert, og hvordan de brukes under in vivo eksperimenter. Grisen-back system gjør en etterforsker til å kombinere en enkelt tønne opptak elektrode av vilkårlig eiendom (motstand, tip størrelse, form etc) med en multibarrel narkotika elektroden. Dette er en stor fordel i forhold til standard multi-elektroder, der alle fat har mer eller mindre lignende former og egenskaper. Multibarrel electrodes ble først introdusert over 40 år siden 1-3, og har gjennomgått en rekke forbedringer 2,3 til grisen tilbake typen ble introdusert i 1980 4,5. Her presenterer vi et sett av viktige forbedringer i laboratoriet produksjon av piggy-back elektroder som tillater dyp hjerne gjennomtrengning i intakt in vivo animalske preparater på grunn av en relativt tynn elektrode sjakt som forårsaker minimal skade. Dessuten disse elektrodene kjennetegnes av lave støy innspillinger, og har lav motstand bedøve fat for meget effektiv iontophoresis av de ønskede farmakologiske midler.
Vi beskriver en teknikk som gjør det mulig for manipulering av en enkelt nevronets mikrokretsen in vivo, mens på samme tid slik at for innspillingen av neuron signaler mens den eksperimentelle manipulasjon. Neural kretser er manipulert via iontophoretical anvendelse av synaptiske agonister og antagonister. Den største fordelen med iontoforese overtrykk utstøting er at iontoforese krever ikke fysisk bevegelse av væske fra elektroden i nervevev, og dermed er det ingen bekymring for å forårsake vevsskade gjennom det påførte trykk eller væskevolum. Den store begrensning av denne teknikken er mangel på informasjon om den absolutte medikamentkonsentrasjonen i vevet, og volumet av vev påvirket. Men siden mengder farmakologiske midler slynges med iontoforese er mye mindre og mye mer presist kontrollerbar enn med press utstøting er utvinning fra stoffet programmet vanligvis mye raskere end mye mer komplett. Microiontophoresis har med hell vært brukt i en rekke nervesystemer, sensoriske og andre, og er tilordnet mest vellykket i hjernen områder med liten eller ingen iboende prosessering. Årsaken er at noen av de mates farmakologiske middel kan diffundere fra påføringsstedet til en nærliggende nevron og også manipulere responsen egenskapene nabostaten neuron.
Den separate produksjon av single og multi fat elektroder muliggjør en kombinasjon av elektroder med vilkårlige og urelaterte egenskaper. Trekke elektroder fat sammen og ved hjelp av noen for opptak og noen for iontophoresis formål ville produsere elektrodetuppene med svært lignende egenskaper, slik at elektrodetuppene enten ville bli for stor for enkelt celle opptak, eller for liten for narkotika søknad. Også har den eneste fat spissen går utover multibarrel elektrodetuppene med om lag 20 mikrometer reduserer støy i opptakene, end eliminerer mulige konfunderende aktuelle effekter fra oppbevaring eller utstøting strømmer på nevronets avfyring 3.
Piggy-back multibarrel elektroder først har blitt beskrevet for over 30 år siden 4-6 og har blitt brukt med stor suksess å dissekere nevrale kretser 7-18 19-29. Dermed er metoden per se ikke romanen eller unike. Imidlertid har de spesielle detaljer av elektroden preparering og bruk blitt modifisert gjennom årene, og settet med instruksjoner som er beskrevet her har vist seg å være spesielt lett og vellykket, og har ikke blitt publisert i detalj andre steder i litteraturen. Spesielt, tillater bøying av singelen fat elektrodespissen endelig spissen av grisen tilbake elektrode å være relativt slank (figur 3) og således, tillater opptak fra dyp atomkjerner med minimal skade på hjernen, den utstikkende av singelen fat elektrode over multi-fat elektrode fjerner nesten all vat effekter, som ofte ble nevnt som en ulempe av teknikken tre. Nye detaljer som presenteres her som å ha elektrodespissen peker oppover i løpet av liming prosessen og hvile enkelt fat i sporet på multibarrel elektroden vil sikre en høy suksessrate ved produksjon grisen tilbake elektroder. Teknikken er relativt enkelt og kan typisk være mastret av en nybegynner innen noen få dager.
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet ble støttet av R01 DC 011582 (AK) og RO1 DC011555 (DJT).
Item name | Manufacturer | Comment | Cat. # |
Bunsen burner | Available from: VWR | 17928-027 | |
Two-component dental cement: “Cold cure” dental material | Co-oral-ite Dental Mfg. Co | Available from: A-M Systems, Inc | 525000 |
Two-component dental cement: Denture material crosslinking Liquid Compound | Co-oral-ite Dental Mfg. Co | Available from: A-M Systems, Inc | 525000 |
Liquid glue | Henkel | Available from: Loctite Super Glue | 01-06849 |
Micro-Iontophoresis Unit: Neurophore BH-2 | Harvard Apparatus | Available from: Harvard Apparatus | 65-0200 & 65-0203 |
Insulated silver wire | AM-Systems | Available from: AM-Systems | 785500 |
Horizontal puller | Zeitz DMZ-Universal Puller | Available from: AutoMate Scientific | NA |
Micro-manipulator pieces: electrode holder | WPI | Available from: WPI | M3301EH |
Micro-manipulator pieces: linear stage | Newport 423 Series | Available from: Newport | 423 |
Micro-manipulator pieces: rotation stage | Newport RSP-2 | Available from: Newport | RSP-2 |
Micro-manipulator pieces: z translation | Newport 433 Series | Available from: Newport | 433 |
Micro-manipulator pieces: angle bracket 90 ° to assemble z and xy axis | Newport 360-90 | Available from: Newport | 360-90 |
Micro-manipulator pieces: x translation / linear stage | Newport 423 Series | Available from: Newport | 423 |
Micro-manipulator pieces: y translation / linear stage | Newport 423 | Available from: Series Newport | 423 |
Microscope | Leitz Laborlux 11 | ||
Microscope: objective | Leitz Wetzlar 10x, NA 0.25 | 519760 | |
Microscope: eypieces | Leitz Wetzlar, Periplan 10x/18 | 519748 | |
Microscope: stage | Leitz Wetzlar | 513544 | |
Multibarrel capillary | N/A | Available from: A-M systems, Inc | 612000 |
Sinlge barrel capillary (GC 150F-10) | Harvard Apparatus | Available from: Harvard Apparatus | 30-0057 |
Vertical puller | Narishige model PE-2 | ||
Custom made elements of the Micro-manipulator (marked light blue in Figure 1) | |||
steel plate | |||
tilting base | |||
attachment for electrode holder | |||
Table 2. Manufacturers and item numbers of all equipment and supplies used in the procedure. |