Jontofores av neurala agonister och antagonister vid extracellulär<em> In vivo</em> Inspelningar är ett kraftfullt sätt att manipulera en neuron är mikromiljö. Dessa manipulationer kan enklast göras via piggy-back multibarrel elektroder. Här beskriver vi hur du kan tillverka dem och använda dem under auditiva inspelningar.
In vivo inspelningar från enskilda nervceller kan en utredare för att undersöka bränning egenskaper nervceller, till exempel till följd av sensoriska stimuli. Neuroner erhåller typiskt flera excitatoriska och hämmande afferenta och / eller efferent ingångar som integreras med varandra, och de slutliga uppmätta svar egenskaper neuronen drivs av neurala integrationer av dessa ingångar. För att studera informationsbehandling i neurala system, är det nödvändigt att förstå de olika ingångarna till en neuron eller nervsystem, och de specifika egenskaperna hos dessa ingångar. En kraftfull och tekniskt relativt enkel metod för att bedöma den funktionella rollen av vissa ingångar som en given neuron tar emot är att dynamiskt och reversibelt undertrycka eller eliminera dessa ingångar, och mäta förändringar i neuronens utsignal som orsakas genom denna manipulering. Detta kan åstadkommas genom farmakologiskt förändra neuron närmaste omgivning med piggy-back multibarrel elektrOdes. Dessa elektroder består av en enda pipa inspelning elektrod och en multibarrel drog elektrod som kan bära upp till 4 olika synaptiska agonister eller antagonister. De farmakologiska medel kan appliceras jontoforetiskt vid önskade tidpunkter under experimentet, vilket möjliggör tid kontrollerad leverans och reversibel omkonfigurering av synaptiska inmatningar. Som sådan farmakologisk manipulation av mikromiljön är en kraftfull och enastående metod för att testa specifika hypoteser om neurala kretsen funktion.
Här beskriver vi hur piggy-back elektroder tillverkas, och hur de används under in vivo-experiment. Den piggy-back system kan en utredare att kombinera en enda elektrod fat inspelning av godtycklig egendom (motstånd, spets storlek, form osv) med en multibarrel drog elektrod. Detta är en stor fördel jämfört med vanliga multi-elektroder, där alla tunnor har mer eller mindre liknande former och egenskaper. Multibarrel electrodes infördes först över 40 år sedan 1-3, och har genomgått ett antal design förbättringar 2,3 tills piggy-back typ introducerades på 1980-talet 4,5. Här presenterar vi ett antal viktiga förbättringar i laboratoriet produktionen av piggy-back elektroder som möjliggör deep brain penetration i intakt in vivo djur preparat på grund av en relativt tunn elektrod axel som orsakar minimal skada. Dessutom är dessa elektroder kännetecknas av låg ljudnivå inspelningar, och har låga fat motstånd läkemedel för mycket effektiv jontofores av de önskade farmakologiska medel.
Vi beskriver en teknik som möjliggör manipulering av en enda neuron har mikrokrets in vivo, medan på samma gång gör det möjligt att inspelningen av neuron svar under den experimentella manipulation. Nervbanor manipuleras via iontophoretical tillämpning av synaptiska agonister och antagonister. Den huvudsakliga fördelen med jontofores övertryck utstötning är att jontofores inte kräver fysisk förflyttning av fluid från elektroden till nervvävnad, och därmed finns det ingen oro för att orsaka vävnadsskada genom det pålagda trycket eller vätskevolymen. Den största begränsningen av denna teknik är bristen på information om den absoluta läkemedelskoncentrationen i vävnaden, och volymen av drabbade vävnaden. Eftersom mängderna av farmakologiska ämnen utkastade med jontofores är mycket mindre och mycket mer exakt kontrollerbar än med tryck utmatning är återhämtningen från Drug Application typiskt mycket snabbare end mycket mer komplett. Microiontophoresis har framgångsrikt använts i ett antal neurala system, sensoriska och andra, och tillämpas mest framgångsrikt i områden i hjärnan med liten eller ingen inneboende bearbetning. Anledningen är att en del av den utsprutade farmakologiska medlet kan diffundera från appliceringsstället till en närliggande neuron och även manipulera svar egenskaper angränsande neuronen.
Den separata tillverkningen av enkel-och multi fat elektroder möjliggör en kombination av elektroder med godtyckliga och oberoende egenskaper. Pulling elektrod fat tillsammans och med hjälp av några för inspelning och en del för jontoforetiska ändamål skulle ge elektrodspetsar med mycket likartade egenskaper, så att elektroden tips antingen skulle vara för stor för en enda cell inspelning eller för litet för läkemedel ansökan. Dessutom, med den enda fat spets sträcker sig bortom tips multibarrel elektroden med ca 20 mikrometer kraftigt reducerar brus i inspelningarna, end eliminerar eventuella felkällor aktuella effekter av innehavet eller utstötning strömmar på neuron s bränning 3.
Piggy-back multibarrel elektroder först har beskrivits under 30 år sedan 4-6 och har använts mycket framgångsrikt för att dissekera nervbanor 7-18 19-29. Således är metoden i sig inte ny eller unik. Dock har de speciella detaljerna i elektrodens beredning och användning ändrats under årens lopp, och uppsättningen av instruktioner som beskrivs här har visat sig vara särskilt enkel och framgångsrik, och har inte publicerats i detalj på andra ställen i litteraturen. Speciellt tillåter böjning av den inre tunnan elektrodspetsen sista spetsen av piggy-back elektrod vara relativt smal (figur 3) och därmed tillåter inspelningar från djupa kärnor med minimal skada på hjärnan, den utskjutande av den inre tunnan elektroden över flera fat elektrod bort nästan alla valutort effekter, som ofta nämndes som en nackdel av tekniken 3. Nya detaljer presenteras här som att ha elektrodspetsen pekar uppåt under limning processen och vila den enda pipan i spåret av multibarrel elektroden kommer att säkerställa ett bra resultat vid produktion piggy-back elektroder. Tekniken är relativt enkel och kan normalt behärskas av en novis inom några dagar.
The authors have nothing to disclose.
Arbetet stöddes av R01 DC 011.582 (AK) och RO1 DC011555 (DJT).
Item name | Manufacturer | Comment | Cat. # |
Bunsen burner | Available from: VWR | 17928-027 | |
Two-component dental cement: “Cold cure” dental material | Co-oral-ite Dental Mfg. Co | Available from: A-M Systems, Inc | 525000 |
Two-component dental cement: Denture material crosslinking Liquid Compound | Co-oral-ite Dental Mfg. Co | Available from: A-M Systems, Inc | 525000 |
Liquid glue | Henkel | Available from: Loctite Super Glue | 01-06849 |
Micro-Iontophoresis Unit: Neurophore BH-2 | Harvard Apparatus | Available from: Harvard Apparatus | 65-0200 & 65-0203 |
Insulated silver wire | AM-Systems | Available from: AM-Systems | 785500 |
Horizontal puller | Zeitz DMZ-Universal Puller | Available from: AutoMate Scientific | NA |
Micro-manipulator pieces: electrode holder | WPI | Available from: WPI | M3301EH |
Micro-manipulator pieces: linear stage | Newport 423 Series | Available from: Newport | 423 |
Micro-manipulator pieces: rotation stage | Newport RSP-2 | Available from: Newport | RSP-2 |
Micro-manipulator pieces: z translation | Newport 433 Series | Available from: Newport | 433 |
Micro-manipulator pieces: angle bracket 90 ° to assemble z and xy axis | Newport 360-90 | Available from: Newport | 360-90 |
Micro-manipulator pieces: x translation / linear stage | Newport 423 Series | Available from: Newport | 423 |
Micro-manipulator pieces: y translation / linear stage | Newport 423 | Available from: Series Newport | 423 |
Microscope | Leitz Laborlux 11 | ||
Microscope: objective | Leitz Wetzlar 10x, NA 0.25 | 519760 | |
Microscope: eypieces | Leitz Wetzlar, Periplan 10x/18 | 519748 | |
Microscope: stage | Leitz Wetzlar | 513544 | |
Multibarrel capillary | N/A | Available from: A-M systems, Inc | 612000 |
Sinlge barrel capillary (GC 150F-10) | Harvard Apparatus | Available from: Harvard Apparatus | 30-0057 |
Vertical puller | Narishige model PE-2 | ||
Custom made elements of the Micro-manipulator (marked light blue in Figure 1) | |||
steel plate | |||
tilting base | |||
attachment for electrode holder | |||
Table 2. Manufacturers and item numbers of all equipment and supplies used in the procedure. |