进行阴道灌洗，结晶紫染色法和阴道细胞学评价小鼠发情周期分期鉴定

Summary

在这里，我们介绍了如何识别阶段的小鼠的生殖发情前期，发情期，发情后期，或动情简单的，非侵入性的收集和阴道涂片细胞学评估。我们还介绍了如何阴道细胞学检查反映循环过渡，通过对小鼠的生殖周期的激素水平相关。

Abstract

在啮齿类动物的生殖状态评估是一种快速的方法不仅可用于生殖功能障碍的研究，但也需要生产新的小鼠模型的疾病和调查的激素调节组织变性（或再生）病理挑战。小鼠生殖或发情周期分为4个阶段：发情前期，发情期，发情后期和动情。定义卵巢激素17-β-雌二醇和孕酮的循环水平的波动，促性腺激素促黄体生成和促卵泡激素，黄体生成激素催乳激素信号通过这些生殖阶段过渡。小鼠阴道内的细胞类型学的变化反映了这些潜在的内分泌活动。每日评估有核上皮细胞，角化鳞状上皮细胞，和白细胞阴道涂片中存在的相对比例可以用于识别小鼠发情阶段。程度的侵袭，但是，受聘于收集这些样本可以改变生育状况和引起的炎症反应，可以混淆涂片细胞学检查评估。在这里，我们描述了一个简单的，非侵入性的协议，可以用来确定一个雌性小鼠的动情周期的阶段没有改变她的生殖周期。我们详细介绍了如何区分通过收集和分析阴道分泌物涂片检查的主要细胞类型学在发情周期的四个阶段，我们可以解释这些变化是如何与内分泌状态。

Protocol

1。准备试剂

1. 对于无菌阴道灌洗，高压灭菌双蒸水（DDH _{2 O），}并存储在一个密封的容器中，室温，直到需要。
2. 对于细胞学评估，结晶紫粉0.1克至100毫升DDH _{2 O}拌匀。结晶紫染色（0.1％）可被存储在一个密封的容器中，在室温下，直到需要。

2。收集阴道细胞（阴道灌洗）

1. 胶乳灯泡放置在无菌的200μl的尖端的端部和绘制最多约100微升无菌DDH _{2 O}的前端中使用的灰度作为准则的体积。
2. 鼠标抬起她的笼子笼斗（盖），并把她与她的后腿/后端向您。
3. 紧紧抓住尾巴和提升的后端。鼠标现在只有她的前爪抓料斗。在这一点上，鼠标可能会排尿。如果是这样的，等到排尿站。如果有尿留在阴道的入口，你可能想使用一个单独的尖端（ 即 ，不是你的样品采集头）冲洗开幕多余的DDH _{2 O。}
4. 将在开幕式的阴道，注意不要穿透孔，阴道和宫颈的刺激能诱发假孕大鼠^1,2的DDH _{2 O}填充尖。最近的报告表明，老鼠是不容易受到这种影响仍然应注意的侵袭程度，以尽量减少重复分析^3。
5. 轻轻地踏下灯泡，驱逐一季度的一半量的水（约25-50微升）在开幕阴道管。无尖插入液体会自发地吸进运河。缓慢地释放在灯泡上的压力。流体将撤回到尖。避免释放压力的速度太快，以防止误吸液到灯泡。过滤的尖头可能是有用的用于此目的。
6. 重复前面的步骤使用相同的尖端，灯泡，和流体的4-5倍，在一个单一的样品，以获得足够数量的细胞。
7. 流体放置在玻璃片上，并允许涂抹标本在室温下完全干燥。发情涂片干燥后，可立即染色或存储，并在以后的日子染色。

3。细胞学染色结晶紫* ⁴

1. 将在科普林氏jar文件（或其他可比较的染色容器）中含有的结晶紫染色1分钟干滑动。
2. 删除科普林氏的第二个罐子DDH _{2 O}洗净幻灯片DDH _{2 O}为1分钟。重复以上步骤。
3. 删除多余的DDH _{2 O}幻灯片中一个轻型的组织，雨刮器的边缘，避免接触涂片染色。
4. 移液器约15微升的顶部的涂片和盖的甘油打滑。或者，其他组织学安装试剂可以利用，以获得一个更永久的，非扩散染色。

*这里描述的染色方法是最简单的程序，可以在任何实验室进行。其他的方法可以提供更多的细节。例如，采用巴氏染色法，有核上皮细胞的成熟度来区分不太成熟的细胞染色的粉红色或橙染色的绿松石和更成熟的细胞。这些差异可以被用来举办提前或延迟发情前期。

4。阴道细胞学检查

1. 检查涂片，光镜下观察，以确定细胞类型。结晶紫从细胞中扩散，随着时间的推移使用甘油时，盖片染色后镜检应立即做。在分析时，应采取显微照片记录细胞学检查。
2. 通过检查的entir开始Ë涂抹在较低的放大倍率。选择有代表性的区域并移动到一个更高的放大倍率。您将看到角化鳞状上皮细胞，白细胞，和/或有核上皮细胞（ 具有代表性的结果 ， 图1A-C）。细胞存在的比例将允许你确定你的鼠标动情期，在取样时（ 具有代表性的结果 ， 图1D-G）和她的激素水平（ 讨论 ， 图2）。

5。代表性的成果

细胞学检查：三种主要的类型的细胞中可检测到阴道涂片样品：（1）有核上皮细胞（ 图1A），（2）角化鳞状上皮细胞（ 图1B），和（3）白细胞（ 图1C）。有核上皮细胞胞浆淡染，较暗的彩色质膜，以及一个椭圆形的核（ 图1B）。多形核白细胞，上皮细胞可区别于其形状不规则，深染多态性核，和小尺寸（ 图1C中 ，黑色箭头所示）。如果尿污染本在涂片，尿酸结晶很容易检测到由异种的任何预期类型的细胞（ 图3）的结晶结构体。如果发生这种情况，并不起眼的检测主要的细胞类型，涂抹应该被丢弃，而不是用于举办目的。

分段：涂片中观察到的细胞类型的相对比率上的一天的样品收集（ 图1D-G），可以用来识别你的鼠标的动情周期的阶段。在发情前期，细胞几乎完全集群的圆形，形成有核上皮细胞（ 图1D，代表细胞由白色箭头指示）。在发情期，细胞主要是角化鳞状上皮细胞，存在在密密麻麻的集群（ 图1E，代表细胞的箭头指示）。在发情后期，小深染白细胞占主导地位（ 图1F，代表电池用黑色箭头表示）。角化鳞状上皮细胞中可以观察到，往往在片段，（ 图1F，代表性的细胞用黑箭头表示）。在动情，罕见角化鳞状上皮细胞仍可能存在（ 图1G，代表性的细胞用黑色箭头表示），白细胞仍然占主导地位（ 图1G，代表性的细胞用黑色箭头表示）。发情后期可区别于发情间期核上皮细胞的外观在发情间期（ G>图1G，代表细胞的白色箭头指示）。

图1。阴道涂片的细胞学评估可以用于识别动情期，三个主要类型的细胞中检测到阴道涂片样品的：（A）的有核上皮细胞，（B）的角化鳞状上皮细胞，和（C）的白细胞。涂片这些类型的细胞中存在的比率，可以使用（D）的动情前期，（E）的发情期，（F）的发情后期，或（G）的发情间期中描述的有代表性的结果 ，以确定小鼠。黑色箭头代表角化鳞状上皮细胞E，F和G点。黑色箭头C，F和G点代表leykocytes。在D和G的亮点代表的白色箭头核上皮细胞。

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图2。阴道涂片细胞学检查反映潜在的内分泌活动。还提供了详细讨论。 点击此处查看大图 。

图3。尿酸结晶可能会出现下面的结晶紫染色尿污染的样本 （A）的晶体是透明的，可以是各种尺寸（箭头和盒装（B）中放大的区域）。没有在这一领域存在的细胞。如果字段内的污染进行细胞学染色尿酸结晶存在，它可能难以准确地确定细胞类型，涂抹应该被丢弃。比例尺= 50微米。

Discussion

细胞类型学的这些变化是潜在的内分泌活动的指标。动情前期阶段的动情周期对应的月经周期的⁵人卵泡阶段定义由排卵前增加循环中17-β-雌二醇的水平^6，以及一个小的浪涌在催乳素^7（ 图2，发情前期，左图）。的增加在17-β-雌二醇的间接刺激促性腺激素释放激素神经元的，反过来，激活响应在垂体前叶细胞释放促黄体激素和促卵泡激素的循环^8,9（ 图2的下丘脑和隔垫，发情前期，左图）。取自动物在发情前期阴道分泌物涂片检查，细胞几乎完全是椭圆形的，有核上皮细胞（ 图1D，图2中 ，动情前期，右图）。高峰，卵泡刺激HORM1电平信号排卵进入发情期^10,11。在发情期间，17-β-雌二醇水平下降和催乳素水平峰值^6,7（ 图2，发情期，左侧面板）。阴道脱落细胞涂片的特点是几乎是唯一的检测不规则形角化鳞状上皮细胞通常在团块（ 图2，图1E，发情期，右图）。进入发情后期恰逢连续上涨的孕激素水平^6，对应于开始的¹²人黄体期（ 图2，动情后期，左侧面板）。由于孕激素水平开始上升，在17-β-雌二醇水平在黄体激活^6,13,14（ 图2，动情后期，左侧面板），有一个小高潮。在这个阶段，阴道分泌物涂片检查中存在的细胞类型是零散的，角化上皮细胞和较深的染色白细胞（FIGURË1F， 图2，动情后期，右图）。最后，发生进入发情间期的小鼠和循环黄体酮水平峰值^6，对应于人类晚黄体期^12。回归的黄体导致随后急剧下降，孕激素水平^15,16（ 图2，间情期，左侧面板）。白细胞中占主导地位涂片在动情。角化上皮细胞的频率降低和成核的上皮细胞开始被检测到之前，过渡到动情前期（ 图1G，图2，求偶期，右面板）。

总之，这个简单的，日常的协议可用于生育状况没有改变，如果采取以下的预防措施，估计每天荷尔蒙的波动，并建立实验小鼠的动情期。抽样应在不超过每日一次使用的非侵入性的协议递减ribed相比，阴道，愿望和搅拌，反复渗透。这可能会导致阴道刺激导致的炎症反应¹⁷白细胞和其它类型的细胞中产生的，是本涂片可能混淆细胞学评估。此外，即使在殖民地安置女性，这是正常的扩展发情间期和发情阶段，在不同的鼠标，以及诱导休情期¹⁸和识别的解释是非常有用的激素影响生殖，性别，疾病的研究。随着年龄的增长和住房群内差异（个人或集团-房屋）的女性^7,19-21还引入了变异周期长。女性女性，只有殖民地坐落在停止循环，并进入虽然循环可以重新设置曝光网箱预处理引起男性尿液循环^24,25长期动情^18,22,23的状态。因此，要建立个别升周期长度的给定的鼠标，建议每日执行这里描述的非侵入性的评估，小心使用，直到观察到两个完整的周期。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterile 200 μl pipette tips	Diamed	E340901
Latex bulb (1 ml)	Fisher	03-488-21
Glass microscope slides	Fisher	12-550-15
Crystal Violet stain (25 g)	Fisher	C581-25
Light-duty Tissue Wipers	VWR	82003-820
Glycerol	Fisher	BP229-1
Microscope Cover Glass (22x30)	Fisher	12-544A