Her beskriver vi, hvordan man identificerer den fase af murine reproduktive (proestrus brunst, metestrus eller diestrus) ved simpel, ikke-invasiv indsamling og cytologisk vurdering af vaginal udstrygningsprøver. Vi beskriver endvidere, hvordan vaginal cytologi afspejler cirkulerende hormonelle niveauer underliggende overgang gennem den murine reproduktive cyklus.
En hurtig måde at vurdere reproduktiv status hos gnavere er ikke kun nyttig i studiet af reproduktive dysfunktion, men er også nødvendigt for produktionen af nye musemodeller for sygdommen og undersøgelser i den hormonale regulering af væv degeneration (eller regenerering) efter patologisk udfordring. Den murine reproduktiv (eller østrus) cyklus er opdelt i 4 faser: proestrus oestrus, metestrus og diestrus. Definerede udsving i cirkulerende niveauer af ovariesteroider 17-β-østradiol og progesteron, gonadotropinerne luteiniserende og follikelstimulerende hormoner, og luteotropic hormonet prolaktin signalovergang gennem disse reproduktive stadier. Ændringer i celle typologi i den murine skeden afspejler disse underliggende endokrine begivenheder. Daglig vurdering af det relative forhold mellem kerneholdige epitelceller, forhornede skæl-epitelceller og leukocytter forekommer i vaginale udstrygninger kan anvendes til at identificere muse østrustrin. Graden af invasiv imidlertid anvendes til indsamling af disse prøver kan ændre reproduktionsstatus og fremkalder en inflammatorisk reaktion, kan forvirre cytologisk evaluering af udstrygninger. Her beskriver vi en enkel, ikke-invasiv protokol, som kan anvendes til at bestemme fase af estrale periode af en hun-mus uden at ændre sin reproduktive cyklus. Vi detaljer, hvordan at skelne mellem de fire faser af estrale cyklus ved indsamling og analyse af dominerende celle typologi i vaginale udstrygninger og vi viser hvordan disse ændringer kan fortolkes med hensyn til endokrin status.
Disse ændringer i celle typologi er tegn på underliggende endokrine begivenheder. Den proøstrus fase af estrale periode svarer til den humane follikulære fase af menstruationscyklen 5 og er afgrænset af en præ-ovulatoriske stigning i cirkulerende 17-β-østradiol 6, og en lille stigning i prolactin 7 (figur 2, proøstrus, venstre panel). Stigningen i 17-β-estradiol indirekte stimulerer gonadotropin-frigivende hormon neuroner i hypothalamus og septum, der på sin side aktiverer responsive celler i hypofyseforlappen at frigive luteiniserende hormon og follikelstimulerende hormon i kredsløbet 8,9 (figur 2 , proøstrus, venstre panel). I vaginale udstrygninger fra dyrene i proøstrus, er celler næsten udelukkende ovale kerneholdige epitelceller (figur 1D, figur 2, proøstrus, højre panel). Toppen i follikelstimulerende Hormen niveauer signaler ægløsning og trådt i brunst 10,11. Under oestrus, niveauer 17-β-østradiol falde, og prolactin-niveauer peak 6,7 (fig. 2, oestrus, venstre panel). Vaginale udstrygninger er karakteriseret ved næsten udelukkende påvisning af uregelmæssigt formede forhornede skæl-epitelceller ofte i klumper (figur 1E, figur 2, oestrus, højre panel). Træder i metestrus falder sammen med en fortsat stigning i progesteron hormon niveauer 6 og svarer til begyndelsen af human luteale fase 12 (fig. 2, Metestrus, venstre panel). Da progesteron niveauer begynde at stige, og der er en lille stigning i 17-β-østradiol som reaktion på corpus luteum aktivering 6,13,14 (fig. 2, Metestrus, venstre panel). De celletyper stede i vaginale udstrygninger i denne fase er fragmenterede, forhornede epithelceller og mindre mørkere farvede leukocytter (Figure 1F, figur 2, Metestrus, højre panel). Endelig træder i diestrus i mus forekommer og cirkulerende progesteron niveauer peak 6, svarende til den humane sen luteal fase 12. Regression af corpus luteum fører til en efterfølgende kraftigt fald i progesteronniveauer 15,16 (fig. 2, Diestrus, venstre panel). Leukocytter dominerer i udstrygningspræparater under diestrus. Frekvensen af forhornede epitelceller reduceres og kerneholdige epitelceller begynder at blive detekteret umiddelbart før overgangen til proestrus (figur 1G, figur 2, Diestrus, højre panel).
Sammenfattende kan denne enkle, rutine protokol bruges til at vurdere daglige hormonelle svingninger og etablere østrus etape i forsøgsmus uden at ændre reproduktive status, hvis følgende forholdsregler er taget. Prøverne udtages højst en gang dagligt under anvendelse af ikke-invasive protokol described her sammenlignet med gentagen indtrængning i vaginalkanalen, aspiration, og omrøring. Dette kan forårsage vaginal irritation resulterer i en inflammatorisk respons 17 resulterer i leukocyter og andre celletyper til stede i udstrygningspræparater, som kan forvirre cytologisk evaluering. Selv i koloni opstaldede hunner, er det normalt at se udvidede diestrus og østrus stadier i forskellige mus samt induktion af anestrous 18 og denne identifikation er nyttig i fortolkningen af hormonal virkning i reproduktiv, køn og sygdom studier. Variation i cyklus længde er også indført med alderen og ved boliger forskelle i kolonier (individuel eller gruppe-kabinet) af hunner 7,19-21. Hunner huse i kvindedominerede kun kolonier kan ophøre cykling og indtaste en tilstand af langvarig diestrus 18,22,23 selvom cykling kan genindsættes ved udsættelse for bure forbehandlet med mandlig urin for at fremkalde cykling 24,25. Således, at etablere individual cykluslængder for en given mus, anbefales det, at de ikke-invasive vurderinger er beskrevet her udføres dagligt, med forsigtighed, indtil to fuldstændige cyklusser overholdes.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Marc Leonard fra Carleton Overvældende Media Studio for sagkyndig teknisk bistand i videoproduktion og redigering og Dr. Martin Bertrand fra Carleton Overvældende Media Studio / Neural Regeneration Laboratorium for visuel model assistance. Forfatterne takker eksperternes råd fra Dr. Marilyn Keaney og alle hendes engagerede personale ved University of Ottawa Animal Care og Veterinary Services. Dette arbejde blev finansieret af den canadiske Institute of Health Research (CIHR, MOP 62.826) til SALB, den CIHR Institute of Aging og Strategic Training Initiative i Health Research / CIHR Training Program i Neurodegenerative Lipidomics (TGF 96.121) til SALB og SF, Canadian Foundation for Innovation til SF, Ontario Innovation Trust til SF, og Autodesk Research til SF. ACM modtager en CIHR Banting og Best ph.d. pris. NV modtager en post-professionel stipendium fra Institut for Aging og CIHR Training Program i Neurodegenerative Lipidomics.
Name | Company | Catalogue # |
Sterile 200 μl pipette tips | Diamed | E340901 |
Latex bulb (1 ml) | Fisher | 03-488-21 |
Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 |
Crystal Violet stain (25 g) | Fisher | C581-25 |
Light-duty Tissue Wipers | VWR | 82003-820 |
Glycerol | Fisher | BP229-1 |
Microscope Cover Glass (22×30) | Fisher | 12-544A |