Här beskriver vi hur du identifierar skede av murina reproduktiva (proestrus brunst, metestrus eller diestrus) genom enkel, icke-invasiv insamling och cytologisk bedömning av vaginala smear prover. Vi beskriver vidare hur vaginal cytologi speglar cirkulerande hormonella nivåer som ligger övergång genom murina reproduktiva cykeln.
En snabb sätt att bedöma reproduktiv status hos gnagare är användbar inte bara i studier av reproduktiv dysfunktion men också för produktion av nya musmodeller av sjukdomen och utredningar i den hormonella regleringen av vävnad degeneration (eller regenerering) efter patologisk utmaning. Den murina reproduktiv (eller estrous) cykel är indelad i 4 steg: proestrus estrus, metestrus och diestrus. Definierade fluktuationer i cirkulerande nivåer av ovariesteroider 17-β-östradiol och progesteron, gonadotropinerna luteiniserande och follikelstimulerande hormoner, och luteotropic hormonet prolaktin signalövergång genom dessa reproduktiva stadier. Förändringar i cell typologi inom murina vaginala kanalen återspeglar dessa underliggande endokrina händelser. Daglig bedömning av det relativa förhållandet mellan kärnförsedda epitelceller, förhornade skvamösa epitelceller och leukocyter närvarande i vaginala utstryk kan användas för att identifiera murin östrusstadier. Graden av invasivitet dock anställd samla in dessa prover kan förändra reproduktiva status och framkalla en inflammatorisk reaktion som kan förbrylla cytologisk bedömning av utstryk. Här beskriver vi en enkel, icke-invasiv protokoll som kan användas för att bestämma stadium av Östrogencykeln för en kvinnlig mus utan att ändra sin reproduktiva cykel. Vi detalj hur att skilja mellan de fyra stegen i estrous cykeln genom insamling och analys av dominerande celler typologi i vaginala utstryk och vi visar hur dessa förändringar kan tolkas med avseende på endokrina status.
Dessa förändringar i cellens typologi tyder på underliggande endokrina händelser. Den proöstrus fasen av estrous cykel motsvarar den humana follikulära fasen av menstruationscykeln 5 och definieras av en pre-ovulatoriska ökningen cirkulerande 17-β-östradiolnivåer 6, liksom en liten ökning i prolaktin 7 (figur 2, proestrus, vänster panel). Ökningen av 17-β-östradiol stimulerar indirekt gonadotropinfrisättande hormon neuroner i hypotalamus och septum som, i sin tur, aktiverar responsiva celler i den främre hypofysen att frigöra luteiniserande hormon och follikelstimulerande hormon i cirkulationen 8,9 (Figur 2 , proestrus vänstra panelen). I vaginala utstryk tagna från djur i proestrus celler är nästan uteslutande ovala kärnförsedda epitelceller (figur 1D, fig. 2, proestrus, höger panel). Toppen i follikelstimulerande Hormen nivå signaler ägglossning och träder i brunst 10,11. Under östrus, 17-β-estradiol nivåer minska och prolaktinnivåer topp 6,7 (Figur 2, estrus, vänstra panelen). Vaginala utstryk kännetecknas av nästan uteslutande detektion av oregelbundet formade förhornade skvamösa epitelceller ofta i klumpar (Figur 1E, figur 2, estrus, höger panel). Ikraftträdande metestrus sammanfaller med en kontinuerlig ökning av nivåerna progesteron hormon 6 och motsvarar början av människans lutealfas 12 (figur 2, Metestrus, vänstra panelen). Som progesteron nivåer börja stiga och det finns en liten ökning i 17-β-estradiol nivåer som svar på gulkropp aktivering 6,13,14 (figur 2, Metestrus, vänstra panelen). De celltyper som finns i vaginala utstryk under detta skede är fragmenterade, förhornade epitelceller och mindre mörkare färgade leukocyter (Figure 1F, 2 figur Metestrus, högra panelen). Slutligen sker inträde i diestrus i möss och cirkulerande progesteronnivåer topp 6, motsvarande den humana sen luteal fas 12. Regression av gulkroppen leder till en efterföljande kraftig nedgång i progesteronnivåer 15,16 (figur 2, Diestrus, vänstra panelen). Leukocyter dominerar i utstryk under diestrus. Frekvensen av förhornade epitelceller reduceras och kärnförsedda epitelceller börjar detekteras strax före övergången till proöstrus (figur 1G, figur 2, Diestrus, höger panel).
Sammanfattningsvis kan denna enkla, rutin protokoll användas för att uppskatta dagliga hormonella svängningar och etablera estrous steg i experimentella möss utan att reproduktiv status om följande försiktighetsåtgärder vidtas. Provtagning ska utföras mer än en gång dagligen med den icke-invasiva protokoll described här jämfört med upprepad penetrering av den vaginala kanalen, aspiration, och omröring. Detta kan orsaka vaginal irritation resulterar i ett inflammatoriskt svar 17 resulterar i leukocyter och andra celltyper att vara närvarande i utstryk som kan förvirra cytologisk utvärdering. Även i koloni hysta kvinnor, är det normalt att se utökade diestrus och estrus stadier i olika möss samt induktion av anestrous 18 och denna identifikation är användbar vid tolkningen av hormonella effekter i reproduktiv, kön och studier sjukdom. Variabilitet i cykellängd godtas också med ålder och bostäder skillnader inom kolonier (individ eller grupp-bostäder) av kvinnor 7,19-21. Kvinnor hålls i kvinnodominerade endast kolonier kan upphöra cykling och ange ett tillstånd av långvarig diestrus 18,22,23 även cykling kan återinföras genom exponering för burar förbehandlade med manlig urin att framkalla cykling 24,25. Således, för att etablera individual cykellängder för en given mus, rekommenderas att de icke-invasiva bedömningar som beskrivs här utföras dagligen, med omsorg, till två kompletta cykler observeras.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Marc Leonard från Carleton Immersive Media Studio för teknisk experthjälp i videoproduktion och redigering och Martin Bertrand från Carleton Immersive Media Studio / neurala Regeneration Laboratoriet för visuell modell hjälp. Författarna erkänner tacksamt expertråd av Dr Marilyn Keaney och alla hennes hängivna personal vid universitetet i Ottawa Animal Care och veterinärtjänster. Detta arbete har finansierats av den kanadensiska Institute of Health Research (CIHR, MOP 62.826) till SALB är CIHR Institutet för Aging och strategisk utbildning initiativet hälsoforskning / CIHR utbildningsprogram Neurodegenerativa Lipidomics (TGF 96.121) till SALB och SF, kanadensisk stiftelse för innovation till SF, Ontario Innovation Lita till SF, och Autodesk Research till SF. ACM får CIHR Banting och Best doktorsexamen utmärkelse. NV får en post-professionell gemenskap från Institute of Aging och CIHR utbildning i Neurodegenerativa Lipidomics.
Name | Company | Catalogue # |
Sterile 200 μl pipette tips | Diamed | E340901 |
Latex bulb (1 ml) | Fisher | 03-488-21 |
Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 |
Crystal Violet stain (25 g) | Fisher | C581-25 |
Light-duty Tissue Wipers | VWR | 82003-820 |
Glycerol | Fisher | BP229-1 |
Microscope Cover Glass (22×30) | Fisher | 12-544A |