Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

3DNA ile Nükleik Asit Yapıları analiz ve Yapı

Published: April 26, 2013 doi: 10.3791/4401
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Chemistry & Chemical Biology and BioMaPS Institute for Quantitative Biology, Rutgers - The State University of New Jersey, 2Department of Biological Sciences, Columbia University

Summary

3DNA yazılım paketi, analiz inşa ve üç boyutlu nükleik asit yapıları görselleştirmek için yetenekleri ile popüler ve çok yönlü biyoinformatik bir araçtır. Bu makale bireysel yapıları ve ilgili yapıların toplulukları hem de uygulanabilir 3DNA mevcut yeni ve popüler özellikler, bir alt kümesi için ayrıntılı protokoller sunar.

Abstract

3DNA yazılım paketi, analiz inşa ve üç boyutlu nükleik asit yapıları görselleştirmek için yetenekleri ile popüler ve çok yönlü biyoinformatik bir araçtır. Bu makale bireysel yapıları ve ilgili yapıların toplulukları hem de uygulanabilir 3DNA mevcut yeni ve popüler özellikler, bir alt kümesi için ayrıntılı protokoller sunar. Protokol 1 yazılımı indirmek ve kurmak için gerekli talimatları kümesini listeler. Bu baz çifti atama ve yapısını açıklamak katı cisim parametrelerin belirlenmesi de dahil olmak üzere bir nükleik asit yapısı, analiz edilmesi ile Protokol 2, olarak, takip ve Protokol 3, bir atom yeniden inşası bir açıklaması olduğunu onun katı cisim parametreleri bir yapı modeli. 3DNA, sürüm 2.1, en son sürümünü, nükleer manyetik rezonans (NMR) ölçümleri ve moleküler dinamik (MD çıkarılabilir gibi yapıların topluluklarından analiz ve manipülasyon için yeni özellikler vardır) Simülasyonları, bu özelliklere Protokoller 4 ve 5'te yer almaktadır. 3DNA tek başına yazılım paketi ek olarak, bulunan w3DNA web sunucusu, http://w3dna.rutgers.edu , yazılımın seçilen özellikleri kullanıcı dostu bir arayüz sağlar. Protokol 6 kullanıcı tarafından belirlenen yerlerde bağlı proteinler ile dekore uzun DNA moleküllerinin modelleri oluşturmak için sitenin bir roman özelliği göstermektedir.

Introduction

DNA, RNA ve proteinler, ilaçlar, ve diğer ligandlar ile kompleksleri, üç boyutlu yapıları anlamak onların çeşitli biyolojik fonksiyonları deşifre için çok önemlidir ve tedavi rasyonel tasarım izin verdiği için. Analizi (şekil ve etkileşim desenleri ayıklamak için), modelleme (enerji bilimi ve moleküler dinamik değerlendirmek için), ve görselleştirme: bu yapıların keşif üç ayrı, ama yakından ilişkili bileşenleri gerektirir. Yapısal analiz ve model oluşturma aynı madalyonun aslında iki yüzü ve görselleştirme her ikisi de tamamlar.

Bilgisayar programlarının 3DNA paketi üç boyutlu nükleik asit yapıları, analiz inşa ve görselleştirmek için yetenekleri ile giderek daha popüler bir yapısal biyoinformatik aracıdır. Önceki yayınlar tarifleri seçilen görevleri 2 gerçekleştirmek için sağlanan yazılım 1, özelliklerini ana hatlarıyla, web tabanlı bir arayüz tanıttıYazılımın 3 popüler özellikleri, yapısal özellikleri sunulan veritabanları kullanılarak toplanmıştır 3DNA 4, 5 ve DNA ve RNA yapıları 6, 7 iki analizinde yazılım programı resimli.

Bu makalenin amacı DNA ve state-of-the-art hesaplama araçları ile RNA mekansal organizasyon araştırmak için ilgi ve / veya ihtiyaçları olan laboratuvar bilim adamları ve başkalarına 3DNA yazılım kiti getirmektir. Burada sunulan protokolleri adım adım talimatlar (i) bir Mac OS X sistem yazılımı indirmek ve yüklemek için, (ii-iii) kurucu baz çifti adımları, düzeyinde DNA yapılarını analiz etmek ve değiştirmek için (dahil iv-v) analiz ve ilgili DNA yapılarının setleri hizalamak, ve (vi) kullanıcı dostu w3DNA web arayüzü ile protein dekore edilmiş DNA zincirleri modelleri oluşturmak için için. Yazılım bireysel yapıları yanı sıra büyük X-ışını kristalografik yöntemlerle çözülmesi analiz yeteneğine sahiptirnükleer manyetik rezonans (NMR) yöntemleri ile veya bilgisayar simülasyonu teknikleri ile üretilen yapıların toplulukları.

Yapılar (i) Borrelia burgdorferi 8 (insan 9, 10 Lyme hastalığı neden olduğu kene kaynaklı bakteri), (ii) den Hbb proteine ​​bağlı DNA yüksek çözünürlüklü kristal yapı içerir Burada sırayla iki büyük setleri incelenmiştir d 4.500 anlık (GGCAAAATTTTGCC) 2 ve d (CCGTTTTAAAACGG) 2 hesaplamalar sırasında 100-İcra Komitesinin artışlarla toplanan ve O3 DNA operatörün NMR tabanlı yapıların (iii) küçük bir topluluk - moleküler simülasyonları 11 ile üretilen ilgili DNA molekülleri Escherichia coli Lac repressör protein 12 başlık parçaları bağlı. Aşağıdaki talimatlar bu yapıların her biri ile hem de nasıl 3DNA (bu dosyanın bir kopyasını bulunursa kullanmak ilişkili atomik koordinatları dosyalara erişmek için hakkında bilgi içerirde 3DNA forumda http://forum.x3dna.org/jove ) bu yapıların incelemek ve değiştirmek için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Yazılım Paketi montajı

  1. De 3DNA web sitesine bağlanmak http://x3dna.org ve 3DNA Forum bağlantısını tıklayın. Forum içindeki 'kayıt' bağlantısını seçin ve yeni bir hesap oluşturmak için yönergeleri izleyin.
  2. Varsayılan bir 'bash' kabuğu ile bir OS X tabanlı Macintosh bilgisayarda yazılım aşağıdaki yönergeleri ayrıntılı kurulum. Yaygın olarak kullanılan kabukları ('tcsh' dahil) ile Linux veya Windows (Cygwin, MinGW / MSYS) sistemleri için prosedür 3DNA Forum içinde bulunan.
  3. Eğer bir kullanıcı adı ve parola kurduktan sonra, Forum oturum. Hoş Geldiniz bölümünde ve yeni bir sayfada 'Dosyalar' bağlantısını '3 DNA indir 'tercih seçin. Bu yazılım çeşitli sürümleri indirilebilir 3DNA indirme sayfasına götürecektir.
  4. Yazılım içeren sıkıştırılmış bir tar dosyası (tar.gz) indirmek için Mac OS X Intel bağlantısını seçin.
  5. Çift clicx3dna-v2.1 adlı bir klasör oluşturmak için (tar.gz) dosyası k. 3DNA yazılım paketi içerir Bu klasör, herhangi bir yere taşınabilir. Bu tarifi amaçla, sürükleyin ve 'Uygulamalar' dizini içine bırakın. Bu aşamada size tar.gz ile bitmiş ve silebilirsiniz.
  6. Tipik olarak 'Kamu' altında bulunan Terminal uygulaması açın ve aşağıdaki komutu (burada ve bir satırbaşı tarafından aşağıdaki tüm talimatları sona erdi) kullanarak Adım 5 oluşturulan x3dna-v2.1 dizini değiştirin:
    cd / Applications/x3dna-v2.1
  7. Yazarak düzgün çalışması için 3DNA için gerekli kurulum komut dosyasını çalıştırın:
    ./bin/x3dna_setup
  8. Adım 7 basılmış iki satırlı ihracat ayarları kopyalayın. Kullanıcı 'Uygulamalar' dizininde yazılım dediyse, iki satır aşağıdaki gibi görünmelidir:
    ihracat X3DNA = / Applications/x3dna-v2.1
    $ PATH: PATH = / Applications/x3dna-v2.1/bin ihracat
    'Uygulamalar' dışında farklı bir kelime Appe olacakkullanıcı farklı bir dizinde yazılımı yüklemek için seçmişse ihracat komut ar. Bu alternatif dizin adı yukarıdaki iki komutları 'Uygulamalar' yerini alacak. Setenv X3DNA / Applications/x3dna-v2.1 ve setenv PATH / Applications/x3dna-v2.1/bin: $ varsayılan kabuk yerine 'bash' bir 'tcsh' ise, iki satır içeriğini olacağını unutmayın PATH.
  9. Adlı bir dosya görmek için 'Bulucu' check-in '. Bashrc' bilgisayarınızda zaten var.
  10. 'Uygulamalar' dizininde bulunan TextEdit uygulamasını açın ve 'Format' menüsü altında 'Düz Metin Yap' seçin.
  11. Adım 9 '. Bashrc' dosyası varsa, TextEdit, dosyayı açın ve Adım 8 dosyanın sonuna kadar dışa aktarma ayarlarını yapıştırın. Hayır '. Bashrc' dosyası çıkar, boş bir dosyaya Adım 8 dışa aktarma ayarlarını yapıştırın ve dosya adını ev dizininde '. Bashrc' ile kaydedin. (Ev dizini Macintosh üzerinde bir 'ev' simgesi ile gösterilir.)
  12. B yeni ayarlar için içinmevcut e, Terminal programı içinde aşağıdaki komutu kullanarak yeni kaydedilmiş '. bashrc' dosyasını çalıştırmanız gerekir:
    kaynak ~ /. bashrc
  13. 3DNA paketi artık sisteminizde yüklü ve Terminal programı içinde Protokolleri 2-5 gerçekleştirebilirsiniz. Protokol 6 3DNA yazılım seçilen özelliklerine w3DNA, bir web arayüzü kullanılarak yapılır.

2. Bir Kristal Yapı Analizi

  1. Biz, Borrelia burgdorferi 8 Hbb proteine ​​bağlı DNA kullanılarak bir nükleik asit yapısının analizi göstermektedir. , Bu yapı ile ilişkili atomik koordinatları dosya Protein Bilgi Bankası 13 (PDB bulunabilir http://www.rcsb.org bu yapısal tanımlayıcı 2np2 atanır,). Takip eden Ek Veri ayrıca 3DNA Forum bulunabilir bu dosyanın bir kopyasını içerir http://forum.x3dna.org/jove.
  2. Yapının 3DNA analizinde ilk adım eşleştirilmiş üsleri listeleyen bir dosya oluşturulmasıdır. Bu aşağıdakileri yazarak 'find_pair' programı ile yapılır:
    find_pair 2np2.pdb 2np2.bps
    Burada 2np2.pdb atomik yukarıda açıklanan koordinatları ve 2np2.bps bir girdi dosyası temel-eşleştirme bilgileri içeren çıktı metin dosyası olduğunu. İkinci baz çifti dosyası incelenmiş ve kullanıcı gerekirse tarafından düzenlenebilir.
  3. Analizde sonraki adım yapısının karakterize geometrik parametreler tespit etmektir. Bu standart kimyasal burulma açıları 14, bazlar ve ardışık baz çifti 16, ve üç boyutlu kimyasal yapısı diğer önlemlerin düzenlemeler belirttiğiniz şeker halkası 15, katı cisim parametrelerin donuk tarif pseudorotation açıları içerir. Komut girdi olarak Adım üretilen baz çifti dosyası alır 2 ve birkaç ou oluşturur 'analiz'Mevcut çalışma dizini görünür tput dosyaları,. Bu değerler aşağıdaki komutu yazarak hesaplanır:
    2np2.bps analiz
    Burada kullanılan çıktı dosyalarını hesaplanan parametrelerin bir genel bakış içerir 2np2.out, ve parametreleri yukarıda açıklanan katı cisim listesini içerir bp_step.par, içerir. İkincisi kolayca dosya daha fazla analiz ve komplo için bir elektronik tablo programı içine okunabilir. Bir örnek için Örnek sonuçlar (Şekil 1) bakın.

3. Sert-vücut Parametreler bir DNA yapısı inşaatı

  1. Bir nükleik asit yapısının analizine ek olarak, 3DNA yazılım 'yeniden oluşturma' komutunu kullanarak katı cisim parametreleri bir yapısal model oluşturmak için yeteneği sağlar. Bu Protokolde ilk Protokolü 2 hesaplanan Hbb-DNA kompleksinden katı cisim parametreleri kullanarak ve sonra w parametreleri değiştirilmiş bir dizi kullanarak, iki DNA sarmal model oluşturmak için nasıl göstermekhich Seçilen rulo açıları değiştirilir. Yatış açısı, DNA 16 olukları içine ardışık baz çifti bükme derecesini ölçmektedir. Rulonun Pozitif değerler, küçük oluk daralması ile büyük yiv ve negatif değerleri daralma ile ilişkilidir. Standart referans çerçevesi 17 3DNA ve diğer popüler nükleik asit analiz yazılımı tarafından kabul edilen, örneğin Eğriler + 18, Watson-Crick baz çiftlerinin hesaplanan parametreleri sayısal tutarlılık sağlar.
  2. Varsayılan olarak, 3DNA 'yeniden oluşturma' fonksiyonu azotlu bazlar atomların sadece koordinatları içeren tam atom modelleri oluşturur. Omurga ve baz atomlar hem koordinatları içeren yaklaşık atom modeli, oluşturmak için, aşağıdaki komutu yazın:
    x3dna_utils cp_std BDNA
    Bu komut katı cisim parametreleri modellerin yapımında standart bir B-DNA omurga şeklinin tanıtmak 3DNA bildirir.
  3. Bui içinHbb-DNA yapısında bulunan katı cisim parametrelerle ld bir çift sarmal modeli, aşağıdakileri yazın:
    yeniden-atom bp_step.par 2np2_rbld_org.pdb
    İşte atom 'tüm ağır (non-hidrojen) atomlar için atomik koordinatları ile bir all-atom modeli yapımı belirtir,' bp_step.par 'girilen katı cisim parametreleri içeren Protokol 2 Adım 3'te oluşturulan dosyadır ve '2 np2_rbld_org.pdb 'oluşturulan yapının atomik koordinatları ile çıktı dosyasıdır. İkincisi dosyası PDB özelliklerine uygun olarak biçimlendirilmiş ve böylece '. Pdb' ile sona erer edilir.
  4. 'Bp_step.par' dosyası değiştirilmiş bir yapı oluşturmak için düzenlenebilir. Macintosh üzerinde değişiklikler Protokol 1 Adım 10'da tarif edildiği gibi TextEdit'le uygulaması kullanarak yapılabilir.
  5. Burada en büyük bükme iki site oluşan aşırı rulo açıları değiştirin. Derece olarak ifade edilen değerler, hat 17 ve 60 64.95 değerlerinden sıfıra değiştirilirDoğrultusunda 26 .93. Biz 'bp_step_roll0.par', yeni bir adla Değiştirilen dosyayı kaydedin ve TextEdit'i programı kapatın.
  6. Biz yazarak giriş dosyası olarak adım parametreleri seti ile değiştirilmiş, Aşama 3'de olduğu gibi, yapı inşa etmek:
    yeniden-atom bp_step_roll0.par 2np2_rbld_roll0.pdb
  7. Iki model gibi pymol (gibi standart moleküler görüntüleyici, görülebilir www.pymol.org giriş olarak oluşturulan koordinat dosyaları (. pdb) kullanarak). Yeniden yapıların görüntüler için Temsilcisi Sonuçlar (Şekil 2) Bkz.

4. Çok modeli Yapıları Dosyalar Analizi

  1. Biz tek bir nükleik asit içeren yapısını analiz hangi Protokol 2, aksine, burada yapıların büyük bir topluluğu analiz nasıl gösterir. Bu moleküler dinamik (MD) simülasyonlar 11'den elde edilen 14 baz çifti DNA zincirinin bir dizi boyunca katı cisim parametrelerinin zaman içindeki değişimi incelemek http://forum.x3dna.org/jove .
  2. Analizde ilk adım 'find_pair' programı çalıştırarak Protokol 2, eşleşmiş bazlar tanımlanmasında gerçekleştirilen aynıdır. Yapıların hisse set tüm bu yana aynı temel-eşleştirme düzeni bir bir temsilci dosya üzerinde sadece bir kez 'find_pair' çalıştırmak gerekiyor. Burada dosya adı md_AT_set1.pdb.1001 ile, adım AT merkezi içeren DNA zincirlerinin simülasyon 1001'inci yapısı seçin. Aşağıdaki talimat cinsBaz-eşleştirme bilgileri tes ve dosya md_AT_set1.bps saklar:
    find_pair md_AT_set1.pdb.1001 md_AT_set1.bps
    Kullanıcı soyma tespit taban incelemek ve yapısı bilgiye dayalı dosyasında manuel değişiklik yapabilirsiniz.
  3. Bir sonraki adım komut 'x3dna_ensemble analiz' ile yapıların set tüm geometrik parametreleri belirlemektir. Program, girdi olarak Aşama 2 (md_AT_set1.bps) yanı sıra, analiz edilecek yapıların bir listesini içeren bir dosya olarak oluşturulan baz-çifti dosyası kullanır. Burada md_AT_set1.list olarak adlandırılan ikinci dosya, MD simülasyon tarafından oluşturulan sırayla tek tek hatlarında girilen dosya adları ile, analiz edilecek 4.500 dosyaları içerir. Bu dosyanın bir kopyası Ek Malzeme dahil ve aynı zamanda 3DNA Forum sunulmaktadır. Kullanıcı hesaplama süresi uzun olabilir, çünkü dosya çok sayıda, uyarılmalıdır (~ bir AMD Phenom II X4 965 işlemcisi 1.000 dosya başına 20 dakika). The komut, aşağıdaki yazarak çalıştırılır:
    x3dna_ensemble analiz-b md_AT_set1.bps-l md_AT_set1.list-o md_AT_set1.out
    Yukarıdaki örnekte Adım 2 oluşturulan baz çifti dosyaya '-b' ilgilidir, '-l' dosyaların listesini verilir belirtir ve '-o' kullanıcı çıktı dosyasına bir isim atamanızı sağlar. Bu belirli modellerde seçimi olarak 'x3dna_ensemble analiz' komutu ile birlikte kullanılabilecek birçok seçenek vardır. Kullanıcı, bu seçenekler hakkında daha fazla bilgi almak için 'x3dna_ensemble analiz-h' yazabilirsiniz.
  4. Bir sonraki adım 3. adımda oluşturulan bakış çıktı dosyası, md_AT_set1.out, arzu edilen katı cisim parametreleri elde etmektir. Bu 'x3dna_ensemble özü' komutu kullanılarak yapılır. Kullanılabilir geometrik parametrelerin bir liste yazarak 'x3dna_ensemble özü-l' bulunabilir. Burada rulo açıları ayıklamak ve aşağıdaki komutu ile rulo açıları bir virgülle ayrılmış metin dosyası (CSV) oluşturun:
    x3dna_ensemble özü-Prulo-s,-f md_AT_set1.out-o md_AT_set1_roll.csv
    Bu komutta '-p rulo' ayıklanmasını parametre belirtir, '-s,' virgülle ayrılmış dosya anlamına, '-f' komutu analiz topluluğu elde edilen çıktı dosyası gösterir ve '-o 'kullanıcı tüm analiz yapılarda DNA boyunca rulo açıları CSV çıktı dosyası isim verir. Bu dosya daha fazla analiz ve grafik için diğer programlara okunabilir. Yukarıda açıklanan iki MD-oluşturulan veri setleri ve bu görüntüleri oluşturmak için kullanılan MATLAB komut dosyası için 3DNA Forum rulo varyasyon analizi için Temsilcisi Sonuçlar (Şekil 3) bakın.

5. Ortak Referans Çerçevesi üzerine Multi-model Yapıları süperpozisyonu

  1. 3DNA (sürüm 2.1) en son sürümü kullanıcı ortak bir bakış açısıyla birden fazla yapı bakmak için olanak sağlayan yeni bir özelliği vardır. 'X3dna_ensemble yeniden yönlendirmek' komutu ile ilgili structur bir koleksiyon üst üste bindirirortak bir baz çifti veya baz-çifti adım es. Aşağıdaki protokol, lac represör proteinin 12'nin başlık parçaları bağlı O3 DNA'nın operatörün NMR türetilmiş yapılar için bu özelliği uygular. Bu yapılar olarak Protokol 4 4.500 modelinden her biri için kullanılan gibi ayrı dosyalar yerine tek bir dosya tüm yapı modelleri içeren bir çoklu-model yapısal dosyasında tanımlayıcı 2kek altında PDB saklanır. Takip eden Ek Veri ayrıca 3DNA Forum bulunabilir bu dosyanın bir kopyasını içerir http://forum.x3dna.org/jove .
  2. Önceki protokolleri gibi, ilk adım 'find_pair' programı ile DNA baz eşleşmesi hesaplamaktır. Bu durumda biz girdi dosyası '2 kek.pdb 'olarak kullanmak ve aşağıdakileri yazın:
    find_pair 2kek.pdb 2kek.bps
    Baz eşleşmesi pdb dosyasında ilk model kullanılarak oluşturulur. Çıktılanan b Manuel düzeltmelerase-çift dosya, '2 kek.bps ', yapının bilgiye dayalı yapılabilir.
  3. Program ortak bir referans çerçevesi üzerinde çok modeli yapı olarak ayrı model uyumlu hale getirecektir 'x3dna_ensemble reorient'. Bu program girdi olarak önceki adımdaki pdb dosyasını ve taban-eşleştirme dosyası hem gerektirir ve aşağıdaki komutu ile çalıştırılır:
    x3dna_ensemble yeniden yönlendirmek-b 2kek.bps-f 1-e 2kek.pdb-o 2kek_fr1.pdb
    İşte '-b' seçeneğini baz-eşleştirme dosyasını belirtir, '-f 1', dizisi taşıyan iplikçik 5'-sonunda bu durumda baz çifti 1, tüm yapıların uyumlu edildiği baz çifti gösterir '-e' giriş topluluğu dosyayı belirtir, ve '-o' kullanıcı bu durumda '2 kek_fr1.pdb 'de, bir çıktı dosyası adı sağlamamıza olanak tanır. Komut seçenekleri hakkında daha fazla bilgi yazarak 'x3dna_ensemble yeniden yönlendirmek-h' elde edilebilir. Uyumlu yapıların tartışma için Temsilcisi Sonuçlar (Şekil 4) Bkz.

6. ConstruBir Protein-dekore edilmiş DNA Molekülü ction

  1. W3DNA web arayüzü 3DNA yazılım paketinin bazı popüler özellikleri içerir. Burada web sunucusu ile protein dekore edilmiş DNA üç boyutlu modeller oluşturmak için yeteneği dikkat çekmek. Bağlanan DNA fragmanları, burada istenilen protein-DNA kompleksleri, Protokol 2 analiz Hbb proteine ​​bağlı DNA değerlerinin katı cisim parametreler kullanabilir. DNA ilişkisiz bölgeler üç kullanıcı tarafından seçilen sarmal formları (A, B veya C) birini kabul edebilir. A, B, ve C sırasıyla 11, 10 ile, erken lif kırınım deneylerden elde edilen DNA üç kanonik modelleri ve çift sarmal 19-21 turda 9 baz çifti bakın.
  2. Bir protein-dekore edilmiş DNA modeli binada ilk adım yer w3DNA web sitesini ziyaret etmektir http://w3dna.rutgers.edu . Sayfa acti üst sol tarafındaki menüden 'İmar' seçimiOnline modeli kurma yetenekleri sokar.
  3. Bir sonraki adım, yeni sayfanın ortasında hafifçe gölgeli kutusunda bulunan 'Bağlı Protein-DNA şablonu' bağlantısını seçmektir. Bu seçim, kullanıcının bağlı proteinlerin sayısını belirlemek için izin veren bir açılır menüden, aktive eder. Burada iki bağlı proteinler seçin ve 'Devam' düğmesini tıklayın. Modelleri 1000 baz çifti veya 2000 nükleotid ve otuz bağlı proteinlere boyutu sınırlı olduğunu unutmayın.
  4. Bağlı proteinler sayısının seçimi Şekil 5 'de gösterilene benzer bir spesifikasyon sayfa yol açar. Bu sayfa, kullanıcının DNA sekansı, ilişkisiz DNA'nın helezon şeklinde ve bağlı proteinler kimlikleri ve konumlarını belirlemek için izin verir.
  5. Özellikleri sayfasının ortasında metin kutusu (Şekil 5, Etiket 1), istenen sırayla kullanıcı türleri veya macunlar. A, T, C, G, ve U - - kabul edilir sadece standart artıkları unutmayın. Burada bir 81 baz çifti Hom girindizisi taşıyan iplikçik olarak bir ile · T çiftleri tamamen oluşan opolymer,.
  6. Bir açılan menü (Şekil 5, Etiket 2) DNA ilişkisiz bölgelerin sarmal konformasyon seçmek için, metin kutusunun altında bulunmaktadır. Bu örnekte, B-form yapı seçin.
  7. Ciltleme pozisyonu (ler) ve bağlı protein (ler) dosya adı (lar) (Şekil 5, Etiket 3) girmek için şartname sayfanın altına yakın bir metin kutusu vardır. Bağlama pozisyonu DNA sekansı üzerinde proteine ​​bağlı fragmanının merkezinin konumu belirtir. Bağlı DNA Hbb-DNA yapısı gibi baz çifti tek sayıda, içeriyorsa, ciltleme pozisyonu parçası ortasında baz çifti yerini gösterir. Hbb bağlı DNA durumunda, bu orta baz çifti, T · T mispair olup. Bu örnekte, DNA şablonuna Hbb proteininin iki kopya bağlarlar, T · T pozisyonları çifti 20 ve 81 baz çifti DNA SE 63 yerleştirilirsekans. Bağlama fragmanının sekansı ile aynı olmak zorunda değildir Not Adım 5 girmiştir. Proteine ​​bağlı bölge baz çifti bir çift sayı içeriyorsa, ciltleme pozisyonu DNA üzerinde orta baz-çifti aşamasının yerini gösterir. Diğer bir deyişle, bağlı fragmanının merkezi baz-çifti adım baz çifti n ve n parça boyunca, belirtilen sayıda n +1 arasına yerleştirilir. Ayrıca bilinen ve standart PDB biçimini 13 depolanan kullanıcı kadar uzun DNA ile kompleks bir yapı olarak bir protein ile DNA dekore not edin.
  8. Özellikleri sayfasının altındaki kullanıcı proteine ​​bağlı DNA (Şekil 5, Etiket 4) bir önizlemesini oluşturmak sağlayan bir kutusu vardır. Burada bu onay kutusunu ve 'Devam' düğmesini tıklayın. Bu eylem, seçilen parametreler yanı sıra seçilen bağlayıcı sitelerin örtüşme ortaya çıkabilecek herhangi bir hata listeleyen bir yorum sayfası oluşturur. Kullanıcı se olabilirherhangi bir değişiklik yapılan veya devam etmek için 'Oluştur' düğmesine gerekiyorsa 'Geri' düğmesini bilirsiniz.
  9. Bir sonraki sayfada, en geniş düzenleme DNA-protein kompleksinin statik bir görüntü görüntüler ve Jmol ve Webmol ile on-line interaktif görselleştirme sağlar. Kullanıcı ayrıca PDB özelliklerine uygun olarak biçimlendirilmiş bir koordinat (. Pdb) dosyayı indirebilirsiniz. Bu oluşturulan görüntü altında 'yeniden pdb dosyasını indirin' seçerek yapılır. İkincisi kolayca dosya daha görselleştirme için bir moleküler grafik programına okunabilir. Hbb dekore edilmiş DNA örnekleri için Temsilcisi Sonuçlar (Şekil 6) Yukarıda açıklanan ve pozisyonlar 20 ve 67 de Hbb merkezli ile biraz daha uzun (86 baz çifti) zinciri bakın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

3DNA yazılım araçları rutin nükleik asit yapıları analiz etmek için kullanılır. Örneğin, baz çiftlerinin kimlikleri ve DNA ve RNA yapılarının çift sarmal parçaları bazların düzenlemeleri karakterize katı cisim parametreler otomatik nükleik asit veritabanı 22, dünya çapında bir depo her yeni giriş için hesaplanır ve saklanır nükleik asit yapısal bilgi. Protokol 2 ile belirlenen katı cisim parametrelerinin değerleri hali hazırda bulunan, bu tür büyük pozitif bir rulo açıları (64.95 ° ve 60.93 °) ile birlikte, önemli bir oluk içine bükme aşırı iki DNA siteleri olarak, üç boyutlu yapıda düzenli bozulmalar ortaya Borrelia burgdorferi Hbb protein 8 (Şekil 1) ile kristal karmaşık adım 13 ve 22 AT · AT.

Protokol 3 ile bu miktarda yapıların yeniden inşa etmek için yazılımın yeteneği mümkün belirlemek için yapar nasılMünferit temel ve temel-çifti adımları genel moleküler kat katkıda bulunur. Şekil 2'de gösterildiği gibi, Hbb tarafından uyarılan DNA küresel bükme iki uç rulo bozulmaları yukarıda belirtildiği gibi daha fazla yansıtır. Yani, DNA bu baz çifti adımlarla yeniden zaman son derece kavisli kalır iki site de boş rulo açıları ile yani, doğruldu. Aynı tekniği daha önce bakteriyel özgü baz çifti adımlar ve deformasyonların nükleozom temel parçacık 6 yüzeyinde sarılmış DNA süpersarmal adım ve bağlı DNA küçük oluk genişliğine katkıları ortaya koymuştur nükleoit- ilişkili protein Fis 23.

Ilgili yapıların çok sayıda incelemek için Protokol 4'te tarif 3DNA içinde yeni özelliği, mümkün simüle edilmiş DNA ve RNA moleküllerinin uzamsal düzenlemelerde, hem dizi-ve zamana bağımlı desenleri elde etmek yapar. Örneğin, (sarı) Colsimüle DNA yapıları 11 iki büyük set halinde izleyen baz çifti arasındaki rulo açıları veya-kodlama pirimidin-pürin baz çifti adımları (Şekil 3) bu moleküllerin tercihli bükme ortaya koymaktadır. DNA ucunda kısa süreli devam kırmızı tasvir rulo yüksek değerler, lokalize erime düşündüren ve çift sarmal yapısının reannealing. Bu açıları ve tamamlayıcı bazlar arasındaki mesafe gibi diğer katı cisim parametreleri, en varyasyonel modelleri deşifre kesin yapısal bozukluklar için yardımcı olabilir.

Ortak bir referans çerçevesi içinde ilgili moleküller yeniden yönlendirmek için Protokol 5'te sunulmaktadır 3DNA yazılımı, bir özelliği, PDB saklanan dosyalardan birçok gizli genel yapısının özelliklerini ortaya koymaktadır. Örneğin, karşılık gelen atomlu bir kök-ortalama-kare uyum bazında, ilgili yapıların geleneksel uyum benzer uzaysal yollarının bir dizi T üretirşapka kabaca O3 DNA operatörün on NMR-tabanlı modeller Lac repressör protein 12 (Şekil 4 sol) ve başlık parçaları bağlı burada, biri diğerinin üzerine üst üste. Her dubleks 5 '-terminal baz çifti ortak bir koordinat çerçevesi aynı yapıların süperpozisyon molekülleri kayda değer farklı yönlerde (sağ Şekil 4) esnek olduğu küresel yapının oldukça büyük bir çarpıtma, ortaya koymaktadır. Yapısal değişkenlik Escherichia coli Lac represör proteini O3 bağlar ve lac operon 24 O3 ve ardışık olarak uzak operatörleri arasında bir döngü neden kolaylığını etkileyebilir.

Protokol 6 özetlenen adımlar, proteinler ve diğer ligandlar ile keyfi sitelerde dekore uzun DNA parçalarının modelleri oluşturmak için, büyük makromoleküler meclisleri örgütlenmesi yeni bir bakış açısı ekler. Bu modeller çok moleküler kompleksleri anlamak için yardımcıbiyolojik işleme sırasında etkileşim. Şekil 6'da gösterildiği gibi, Hbb gibi bir mimari proteinin tam yerleşimini DNA genel katlama üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Bilinen yüksek çözünürlüklü yapısı 8 iki kopyası 43 baz çifti ayrılır ise, bir 81-baz çifti DNA parçası sıkı, neredeyse kapalı yapılandırma içine kapanır. İki protein, bir ek beş baz çifti ayrılmış ise, söz konusu DNA, bir açık, dolambaçlı yol izler. Protein dekore dubleks gösterinin çok farklı düzenlemeler nasıl mimari proteinlerin boşluk DNA 25, 26 halkalaşmasıyla veya döngü etkileyebilir.

Şekil 1
Şekil 1. DNA cha boyunca ardışık baz çifti arasındaki yatış açısı değişimi (görsel tasviri için ekine bakın)Borrelia burgdorferi 8 Hbb proteinlerine bağlanır. 3DNA bölgesinin 'analiz' komuta ve Protokol 2 'de tarif edilen yapısal veriler kullanılarak elde edilmiştir. Adımları AT de rulonun uç değerler Not dirsek yapının merkezi üçüncü.

Şekil 2,
Şekil 2. Renk kodlu atomlar (, N-mavi, O-kırmızı, p-altın C-mavi) ile pymol işlenen 'yeniden' 3DNA fonksiyonu ve kullanılarak inşa DNA yaklaşık atom modelleri. Hbb protein ve rulo en büyük iki değeri sıfıra ayarlanmış adım parametrelerin (sağ) değiştirilmiş bir dizi (sol) katı cisim adım parametrelere dayalı modeller. Adım adım talimatlar için protokol 3 bakınız . Rulo empoze edilen değişimler sonucu DNA açılımı edin.


Şekil 3,. Simüle yapıların 11 iki takım içinde DNA boyunca rulo açıları mozaik görüntüler. Protokolü 4 ile elde rulo değerleri, aralığında maviden kırmızıya renk kodludur [-5 °, 20 °]. Iki adet 14 baz çifti kendi kendini tamamlayan dizileri pirimidin-pürin adımları meydana sarı / kırmızı sütunlar, tarafından vurgulanan üsleri ve rulo büyük değerlerin ters, unutmayın.

Şekil 4,
Şekil 4. Yetenekleri açıklayıcı lac represör proteinin başlık parçaları 12 ile O3 DNA'nın operatörün NMR türetilmiş yapılarda bulunan DNA modelleri çizgi görüntüpymol (omurgaları mavi sopa olarak altın tüpler ve bazlar gibi göstermek) işlenir ve (sol) PDB girişi (2kek) olarak koordinatları ve Protokol 5 sunulan (sağ) yapısal süperpozisyon kullanarak uyumlu komut 'x3dna_ensemble reorient'. Görüntüler . 5'-uç baz çifti ortak bir referans çerçeve içine yerleştirildi yapılar arasında büyük farklılıklar not edin.

Şekil 5,
Şekil 5,. Ekran w3DNA web sunucusundan DNA dizisinin gösteren özellikleri (Etiket 1), ilişkisiz DNA sarmal şeklinde (Etiket 2), pozisyonları ve proteinlerin kimlikleri (Etiket 3) ve önizleme resmi onay kutusunu (Etiket 4) vurdu Protokol 6'da açıklandığı. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 6,
6 Şekil. Uzun bir DNA parçası bağlı iki Hbb protein 8 yaklaşık atom modelleri. Protokolü 6. açıklanan ve pymol yılında işlenen w3DNA web sunucusu ile oluşturulan yapılar. DNA atom tipi (, N-mavi, O-kırmızı, p-altın C-mavi) ile renkli kodlu ise protein zincirleri mor kurdele gibi göstermek vardır. Her protein bağlayıcı sitelerin merkezi baz çifti pozisyonlarda ayarlanır 86 baz çifti DNA zinciri boyunca (sol) 20 ve 62 81 baz çifti DNA zinciri boyunca ve (sağda) 20 ve 67. Iki proteinin artan (beş baz çifti) yer değiştirmesi ile bağlantılı yapıların katlama büyük değişiklik not edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu makalede sunulan protokoller kümesi sadece programların 3DNA paketinin yeteneklerini değinmek. Bu araçlar, vb gibi eşleştirme ortaya çıktığı, ikincil yapı bağlamında belirlemek için sarmal parçaları mekansal eğilim ölçmek için, zincir omurgası boyunca bazlar örtüşme ölçmek için, kurallı olmayan baz çifti tespit etmek yapıları RNA uygulanabilir Yeniden oluşturma komut, kullanıcının 1 Şekil ilave göründüğü üsleri ve baz çifti basit ve bilgilendirici blok gösterimleri oluşturmanıza olanak sağlar. Bina araçları da çok sayıda çift, üç ve dört iplikli DNA yapılarının modelleri oluşturmak için, belirli bir yapısal şablonu 'Konu' farklı dizileri özellikler, belirli bir yönde yönlendirmek modelleri, vb Son olarak, 3DNA vardır , için SANATLAR web sunucusu nükleik asitler 27 için SwS solvasyon web hizmeti: gibi diğer projeler, bir dizi önemli bir rol oynadıhizalama RNA üçüncül yapıları 28; moleküler dinamik sonuçları ve yapısı tahmini 29 analizi için MDDNA web tabanlı bir araç, HADDOCK bilgi odaklı protein-DNA yerleştirme yöntemi 30; RNA yapıları 31 fonksiyonu açıklama için SARA sunucu, 3D- DART DNA yapısı modelleme sunucu 32; protein-DNA kompleksleri 33 yapısal analizi için 3D-ayak izi veritabanı; RNA yapıları 34 içinde üç boyutlu parçaları belirlenmesi için RNA FRABASE 2.0 veritabanı ve ikili karşılaştırma için SETTER web sunucusu RNA yapılarını 35. Bildiğimiz kadarıyla en iyi için, özellikleri ve 3DNA en güçlü performans göstermiş bir benzer geniş bir kombinasyonu ile başka bir nükleik asit yapısı yazılım paketi bulunmuyor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Biz moleküler dinamik simülasyonları üretilen DNA çift sarmal koordinatları paylaşımı için Jiří Sponer minnettarız. Ayrıca bu yapıların indirme yardım için Nada Spackova kabul. USPHS Araştırma Fonları ile bu işin destek GM34809 ve GM096889 minnetle kabul edilmektedir.

References

  1. Lu, X. -J., Olson, W. K. 3DNA: a software package for the analysis, rebuilding, and visualization of three-dimensional nucleic acid structures. Nucleic Acids Res. 31, 5108-5121 (2003).
  2. Lu, X. -J., Olson, W. K. 3DNA: a versatile, integrated software system for the analysis, rebuilding, and visualization of three-dimensional nucleic-acid structures. Nature Protocols. 3, 1213-1227 (2008).
  3. Zheng, G., Lu, X. -J., Olson, W. K. Web 3DNA-a web server for the analysis, reconstruction, and visualization of three-dimensional nucleic-acid structures. Nucleic Acids. Res. 37, W240-W246 (2009).
  4. Xin, Y., Olson, W. K. BPS: a database of RNA base-pair structures. Nucleic Acids Res. 37, D83-D88 (2009).
  5. Zheng, G., Colasanti, A. V., Lu, X. -J., Olson, W. K. 3DNALandscapes: a database for exploring the conformational features of DNA. Nucleic Acids Res. 38, 267-274 (2010).
  6. Tolstorukov, M. Y., Colasanti, A. V., McCandlish, D., Olson, W. K., Zhurkin, V. B. A novel 'roll-and-slide' mechanism of DNA folding in chromatin. Implications for nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 371, 725-738 (2007).
  7. Lu, X. -J., Olson, W. K., Bussemaker, H. J. The RNA backbone plays a crucial role in mediating the intrinsic stability of the GpU dinucleotide platform and the GpUpA/GpA miniduplex. Nucleic Acids Res. 38, 4868-4876 (2010).
  8. Mouw, K. W., Rice, P. A. Shaping the Borrelia burgdorferi genome: crystal structure and binding properties of the DNA-bending protein Hbb. Mol. Microbiol. 63, 1319-1339 (2007).
  9. Burgdorfer, W., Barbour, A. G., Hayes, S. F., Benach, J. L., Grunwaldt, E., Davis, J. P. Lyme disease-a tick-borne spirochetosis? Science. 216, 1317-1319 (1982).
  10. Benach, J. L., Bosler, E. M., Hanrahan, J. P., Coleman, J. L., Habicht, G. S., Bast, T. F., Cameron, D. J., Ziegler, J. L., Barbour, A. G. Spirochetes isolated from the blood of two patients with Lyme disease. N. Engl. J. Med. 308, 740-742 (1983).
  11. Lankaš, F., Špačková, N., Moakher, M., Enkhbayar, P., Šponer, J. A measure of bending in nucleic acids structures applied to A-tract DNA. Nucleic Acids Res. 38, 3414-3422 (2010).
  12. Romanuka, J., Folkers, G. E., Biris, N., Tishchenko, E., Wienk, H., Bonvin, A. M. J. J., Kaptein, R., Boelens, R. Specificity and affinity of Lac repressor for the auxiliary operators O2 and O3 are explained by the structures of their protein-DNA complexes. J. Mol. Biol. 390, 478-489 (2009).
  13. Berman, H. M., Westbrook, J., Feng, Z., Gilliland, G., Weissig, H., Shindyalov, I. N., Bourne, P. E. The Protein Data Bank. Nucleic Acids. Res. 28, 235-242 (2000).
  14. Joint, I. U. P. A. C. -I. U. B. Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) Abbreviations and symbols for the description of conformations of polynucleotide chains. Eur. J. Biochem. 131, 9-15 (1983).
  15. Altona, C., Sundaralingam, M. Conformational analysis of the sugar ring in nucleosides and nucleotides. A new description using the concept of pseudorotation. J. Am. Chem. Soc. 94, 8205-8212 (1972).
  16. Dickerson, R. E., Bansal, M., Calladine, C. R., Diekmann, S., Hunter, W. N., Kennard, O., von Kitzing, E., Lavery, R., Nelson, H. C. M., Olson, W. K., et al. Definitions and nomenclature of nucleic acid structure parameters. J. Mol. Biol. 205, 787-791 (1989).
  17. Olson, W. K., Bansal, M., Burley, S. K., Dickerson, R. E., Gerstein, M., Harvey, S. C., Heinemann, U., Lu, X. -J., Neidle, S., Shakked, Z., et al. A standard reference frame for the description of nucleic acid base-pair geometry. J. Mol. Biol. 313, 229-237 (2001).
  18. Lavery, R., Moakher, M., Maddocks, J. H., Petkeviciute, D., Zakrzewska, K. Conformational analysis of nucleic acids revisited: Curves+. Nucleic Acids Res. 37, 5917-5929 (2009).
  19. Franklin, R. E., Gosling, R. G. Molecular configuration in sodium thymonucleate. Nature. 171, 740-741 (1953).
  20. Watson, J. D., Crick, F. H. C. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature. 171, 964-967 (1953).
  21. Marvin, D. A., Spencer, M., Wilkins, M. H. F., Hamilton, L. D. A new configuration of deoxyribonucleic acid. Nature. 182, 387-388 (1958).
  22. Berman, H. M., Olson, W. K., Beveridge, D. L., Westbrook, J., Gelbin, A., Demeny, T., Hsieh, S. -H., Srinivasan, A. R., Schneider, B. The Nucleic Acid Database: a comprehensive relational database of three-dimensional structures of nucleic acids. Biophys. J. 63, 751-759 (1992).
  23. Stella, S., Cascio, D., Johnson, R. C. The shape of the DNA minor groove directs binding by the DNA-bending protein Fis. Genes Dev. 24, 814-826 (2010).
  24. Swigon, D., Coleman, B. D., Olson, W. K. Modeling the Lac repressor-operator assembly: the influence of DNA looping on Lac repressor conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 9879-9884 (2006).
  25. Czapla, L., Swigon, D., Olson, W. K. Effects of the nucleoid protein HU on the structure, flexibility, and ring-closure properties of DNA deduced from Monte-Carlo simulations. J. Mol. Biol. 382, 353-370 (2008).
  26. Czapla, L., Peters, J. P., Rueter, E. M., Olson, W. K., Maher, L. J. 3rd Understanding apparent DNA flexibility enhancement by HU and HMGB proteins: experiment and simulation. J. Mol. Biol. 409, 278-289 (2011).
  27. Auffinger, P., Hashem, Y. SwS: a solvation web service for nucleic acids. Bioinformatics. 23, 1035-1037 (2007).
  28. Dror, O., Nussinov, R., Wolfson, H. J. The ARTS web server for aligning RNA tertiary structures. Nucleic Acids Res. 34, 412-415 (2006).
  29. Dixit, S. B., Beveridge, D. L. Structural bioinformatics of DNA: a web-based tool for the analysis of molecular dynamics results and structure prediction. Bioinformatics. 22, 1007-1009 (2006).
  30. de Vries, S. J., van Dijk, M., Bonvin, A. M. The HADDOCK web server for data-driven biomolecular docking. Nat. Protoc. 5, 883-897 (2010).
  31. Capriotti, E., Marti-Renom, M. A. SARA: a server for function annotation of RNA structures. Nucleic Acids Res. 37, 260-265 (2009).
  32. van Dijk, M., Bonvin, A. M. 3D-DART: a DNA structure modelling server. Nucleic Acids Res. 37, W235-W239 (2009).
  33. Contreras-Moreira, B. 3D-footprint: a database for the structural analysis of protein-DNA complexes. Nucleic Acids Res. 38, D91-D97 (2010).
  34. Popenda, M., Szachniuk, M., Blazewicz, M., Wasik, S., Burke, E. K., Blazewicz, J., Adamiak, R. W. RNA FRABASE 2.0: an advanced web-accessible database with the capacity to search the three-dimensional fragments within RNA structures. BMC Bioinformatics. 11, 231 (2010).
  35. Čech, P., Svozil, D., Hoksza, D. SETTER: web server for RNA structure comparison. Nucleic Acids Res. , (2012).

Tags

Genetik Sayı 74 Moleküler Biyoloji Biyokimya Biyomühendislik Biyofizik Genomik Kimya Biyoloji Sayısal Biyoloji konformasyon analizi DNA yüksek çözünürlüklü yapılar model kurma moleküler dinamik nükleik asit yapısı RNA görselleştirme biyoinformatik üç- boyutlu 3DNA yazılım
3DNA ile Nükleik Asit Yapıları analiz ve Yapı
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Colasanti, A. V., Lu, X. J., Olson,… More

Colasanti, A. V., Lu, X. J., Olson, W. K. Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA. J. Vis. Exp. (74), e4401, doi:10.3791/4401 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter