שיטה חדשה כרוכה בניתוח כמותי של סריג (העברת אנרגית פורסטר תהודה) אותות מתוארת ללימוד קינטיקה אנזים.<em> K<sub> M</sub</em> ו<em> K<sub> חתול</sub</em> התקבלו להידרוליזה של התחום קטליטי של SENP1 (פרוטאז הספציפי SUMO / Sentrin 1) לטרום SUMO1 (משתנה קטן יוביקוויטין דמוי). העקרונות הכלליים של מחקר הכמותי קינטית-סריג מבוסס פרוטאז יכולים להיות מיושמים על פרוטאזות אחרות.
שינויי posttranslational הפיכים של חלבונים עם חלבוני ubiquitin או יוביקוויטין דמויים (Ubls) נמצאים בשימוש נרחב באופן דינמי כדי לווסת את פעילות חלבון ויש תפקידים מגוונים בתהליכים ביולוגיים רבים. לדוגמה, SUMO קוולנטית משנה כמה גדולים או חלבונים עם תפקידים חשובים בתהליכים תאיים רבים, כולל הסדרת מחזור התא, הישרדות תא ומוות, בתגובת ניזק לדנ"א, ומתח תגובת 1-5. SENP, כפרוטאז SUMO ספציפי, מתפקד כendopeptidase בהתבגרות של מבשרי סומו או כisopeptidase להסיר SUMO מחלבוני המטרה שלו ולרענן את מחזור SUMOylation 1,3,6,7.
ההתייעלות או הסגולי הקטליטית של אנזים מאופיינת הטוב ביותר על ידי היחס בין הקבועים קינטיים, יא החתול / K M. בכמה מחקרים, הפרמטרים קינטיים של זוגות SUMO-SENP נקבעו על ידי שיטות שונות, כולל polyacrylamide ג'ל המבוסס על מערב כולו כתם, radioactive כותרתו מצע מתחם, פלורסנט או חלבון מסומן מצע 8-13. עם זאת, טכניקות ג'ל מבוסס polyacrylamide, המשמשות את החלבונים "ילידים", אלא הן מייגעות ותובעני מבחינה טכנית, שאינם מוכן להשאיל את עצמם לניתוח כמוני מפורט. הושג k חתול / K M ממחקרים באמצעות tetrapeptides או חלבונים עם ACC (7-אמינו-4-carbamoylmetylcoumarin) או AMC (7-אמינו-4-methylcoumarin) fluorophore היו או עד שני סדרי גודל נמוך יותר מאשר המצעים הטבעיים או לא יכול להבדיל באופן ברור את ISO ו-פעילויות endopeptidase של SENPs.
מבחני הפרוטאז לאחרונה, סריג מבוססים שמשו כדי לחקור את אנזימי deubiquitinating (dubs) או SENPs עם זוג סריג של חלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP) וחלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) 9,10,14,15. היחס בין הפליטה לפליטת acceptor תורם שמש כפרמטר הכמותי לסריג צג אות לפרוטאז activity נחישות. עם זאת, שיטה זו התעלמה-זיהומים צולבי אותות ובאורכי גל פליטת acceptor תורם ידי acceptor ותורם עצמי פלואורסצנטי ולכן לא הייתה מדויק.
פתחנו רומן רגיש מאוד וassay פרוטאז סריג מבוסס כמותית לקביעת הפרמטרים קינטיים של התבגרות מראש SUMO1 ידי SENP1. מהונדס סריג CyPet הזוג וYPet עם יעילות השתפרה באופן משמעותי ותשואת סריג קוונטי קרינה, שמשו כדי ליצור את CyPet-(מראש SUMO1) המצע YPet-16. אנו נבדלים ולכמת אותות קרינה מוחלטים נתרמו על ידי התורם וacceptor וסריג באורכי גל acceptor ופליטה, בהתאמה. הערך של k חתול / K M הושג כ( 3.2 ± 0.55) x10 ז 7 -1 של -1 של SENP1 כיוון-SUMO1 מראש, שהיא בהסכם עם פרמטרים קינטיים אנזימטית כלליים. לכן, שיטה זו הנה בתוקף וניתן להשתמש ביsa בכלל ניגשים לאפיין פרוטאזות אחרות גם כן.
טכנולוגית הסריג נעשתה שימוש כדי ללמוד ההתבגרות של טרום SUMO1 ידי SENP1 9. CFP-YFP שמש כזוג סריג וניתוח ratiometric, שהוא היחס של acceptor לפליטה התורמת, שמש ללאפיין את התכונות הקינטיות. עם זאת, אין שיקול של תורם וacceptor העצמי פלואורסצנטי בratiometric המסורתי סריג ניתוח. היחס לא לתאם ישירו…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים מאוד לויקטור GJ רוג'רס לייעוץ רב ערך. אנו מודים לכל חברים בקבוצת ליאו לעבודה משותפת וקרובה מאוד לעזרה במחקר זה. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (גרנט AI076504 לJL).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 |
2xYT | Research Products Internationa.l Corp. | X15600 |
Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 |
Coomassie plus (Bradford) Assay Regent | Thermo Scientific | 23238 |
384-well plate (glass bottom) | Greiner | 781892 |
FlexStation II 384 plate reader | Molecular Device |