Un nuevo método que implica el análisis cuantitativo de FRET (transferencia de energía por resonancia de Förster) señales se describe para el estudio de la cinética de enzimas.<em> K<sub> M</sub</em> Y<em> K<sub> Cat</sub</em> Fueron obtenidos para la hidrólisis del dominio catalítico de SENP1 (SUMO / sentrin proteasa específica 1) para pre-SUMO1 (Small ubiquitina-como modificador). Los principios generales de este estudio cuantitativo proteasa-FRET basada cinética se puede aplicar a otras proteasas.
Reversibles modificaciones postraduccionales de proteínas con proteínas de ubiquitina o ubiquitina como-(Ubls) son ampliamente utilizados para regular dinámicamente actividad de la proteína y tiene diversas funciones en muchos procesos biológicos. Por ejemplo, SUMO modifica covalentemente un gran número o proteínas con papeles importantes en muchos procesos celulares, incluyendo la regulación del ciclo celular, la supervivencia celular y la muerte, la respuesta de daño del ADN, y la respuesta de estrés 1-5. SENP, como SUMO-proteasa específica, funciona como una endopeptidasa en la maduración de los precursores SUMO o como un isopeptidase para eliminar SUMO de sus proteínas diana y refrescar el ciclo SUMOylation 1,3,6,7.
La eficiencia catalítica o la especificidad de una enzima se caracteriza mejor por la relación de las constantes cinéticas, k cat / K M. En varios estudios, los parámetros cinéticos de SUMO-SENP pares han sido determinados por varios métodos, incluyendo en gel de poliacrilamida basado en western-blot, radIOActive sustrato marcado, compuesto fluorescente o proteína sustrato marcado 8-13. Sin embargo, las técnicas de poliacrilamida-gel a base, que utilizaron los "nativos" de proteínas, pero son laboriosos y técnicamente exigente, que no se prestan a un análisis cuantitativo detallado. La obtenido k cat / K M de estudios usando tetrapéptidos o proteínas con un ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) o AMC (7-amino-4-metilcumarina) fluoróforo eran o bien hasta dos órdenes de magnitud menor que los sustratos naturales o no puede diferenciar claramente las iso-y las actividades de endopeptidasa SENPs.
Ensayos de la proteasa Recientemente, basados en FRET se utilizan para estudiar las enzimas deubiquitinating (DUBs) o SENPs con el par de FRET cian proteína fluorescente (PPC) y la proteína amarilla fluorescente (YFP) 9,10,14,15. La relación de emisión de aceptor de emisión del donante se utiliza como el parámetro cuantitativo para FRET monitor de señal de proteasa acdad determinación. Sin embargo, este método ignora la señal contaminaciones cruzadas en el aceptor y longitudes de onda de emisión por donantes aceptor y donante de auto-fluorescencia y por lo tanto no era correcta.
Hemos desarrollado un novedoso altamente sensible y cuantitativo FRET basada en el ensayo de la proteasa para la determinación de los parámetros cinéticos de pre-SUMO1 maduración por SENP1. Un par de ingeniería FRET CyPet y YPet con mejorado significativamente la eficiencia de FRET y rendimiento cuántico de fluorescencia, se usaron para generar el CyPet-(pre-SUMO1)-YPet sustrato 16. Hemos diferenciado y cuantificados absolutos señales de fluorescencia aportados por el donante y el aceptor y FRET en las longitudes de onda de emisión de aceptor y, respectivamente. El valor de k cat / K M se obtuvo como (3,2 ± 0,55) x 10 7 M -1 s -1 de SENP1 hacia pre-SUMO1, que está de acuerdo con los parámetros generales de cinéticas enzimáticas. Por lo tanto, esta metodología es válida y se puede utilizar unsa Enfoque general para caracterizar otras proteasas también.
Tecnología FRET ha sido utilizada para estudiar la maduración pre-SUMO1 de por SENP1 9. CFP-YFP se utilizó como el par de FRET y el análisis radiométrico, que es la relación de aceptor a las emisiones de los donantes, se utilizó para caracterizar las propiedades cinéticas. Sin embargo, no existe ninguna consideración de donante y aceptor de auto-fluorescencia en la ratiométrica tradicional análisis FRET. La relación no se correlacionan directamente con la cantidad de sustrato digerido.
<p clas…The authors have nothing to disclose.
Estamos muy agradecidos a Victor GJ Rodgers por sus valiosos consejos. Agradecemos a todos los miembros del grupo Liao para el trabajo en colaboración muy estrecha y ayuda con este estudio. Este estudio fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (Grant AI076504 a JL).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 |
2xYT | Research Products Internationa.l Corp. | X15600 |
Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 |
Coomassie plus (Bradford) Assay Regent | Thermo Scientific | 23238 |
384-well plate (glass bottom) | Greiner | 781892 |
FlexStation II 384 plate reader | Molecular Device |