Kvantitativ FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analyse for SENP1 Protease Kinetics Bestemmelse
Summary
En ny fremgangsmåte som involverer kvantitativ analyse av FRET (Förster Resonance Energy Transfer) signaler er beskrevet for å studere enzymkinetikk.<em> K<sub> M</sub</em> Og<em> K<sub> Katt</sub</em> Ble oppnådd for den hydrolyse av den katalytiske domenet av SENP1 (SUMO / Sentrin spesifikk protease 1) til pre-SUMO1 (Lie ubiquitin-lignende Modifier). De generelle prinsippene i denne kvantitative-FRET-baserte protease kinetisk studie kan brukes til andre proteaser.
Abstract
Reversible posttranslational modifikasjoner av proteiner med ubiquitin eller ubiquitin-lignende proteiner (Ubls) er mye brukt for å dynamisk regulere protein aktivitet og har forskjellige roller i mange biologiske prosesser. For eksempel endrer SUMO kovalent et stort antall eller proteiner med viktige roller i mange cellulære prosesser, herunder celle-syklus regulering, celle overlevelse og død, DNA skade respons, og stressrespons 1-5. SENP, som SUMO-spesifikk protease, til funksjoner som en endopeptidase i modning av SUMO forløpere eller som en isopeptidase fjerne SUMO fra sine target proteiner og oppdatere SUMOylation syklus 1,3,6,7.
Den katalytiske effektivitet eller spesifisitet av et enzym er best karakterisert ved forholdet mellom de kinetiske konstanter, k cat / K M. I flere studier har de kinetiske parametrene SUMO-SENP par blitt bestemt av ulike metoder, inkludert polyakrylamid gel-basert western-blot, radIOActive-merket substrat, fluorescerende stoff eller protein merket substrat 8-13. Men de polyakrylamid-gel-baserte teknikker, som brukte "innfødte" proteiner, men er arbeidskrevende og teknisk krevende, som ikke lett egner seg til detaljert kvantitativ analyse. Den oppnådde K cat / K M fra studier med tetrapeptid eller proteiner med en ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) eller AMC (7-amino-4-methylcoumarin) fluorofor var enten opptil to størrelsesordener lavere enn de naturlige substratene eller kan ikke tydelig skille ISO-og endopeptidase aktiviteter SENPs.
Nylig FRET-baserte protease analysene ble brukt til å studere deubiquitinating enzymer (Dubs) eller SENPs med FRET par cyan fluorescerende protein (CFP) og gule fluorescerende protein (YFP) 9,10,14,15. Forholdet mellom akseptor utslipp til donor utslipp ble brukt som den kvantitative parameter for FRET signal monitor for protease acduktivitet besluttsomhet. Men ignorert denne metoden signal tvers forurensing på akseptor og donor utslipp bølgelengder akseptor og donor selv fluorescens og dermed var ikke nøyaktig.
Vi utviklet en roman svært følsom og kvantitative FRET-baserte protease analysen for å bestemme kinetiske parametre av pre-SUMO1 modning av SENP1. En konstruert FRET pair CyPet og YPet med betydelig forbedret FRET effektivitet og fluorescens kvanteutbytte, ble brukt til å generere CyPet-(pre-SUMO1)-YPet substratet 16. Vi differensiert og kvantifisert absolutte fluorescens signaler bidratt av giver og akseptor og FRET på akseptor og utslipp bølgelengder, henholdsvis. Verdien av k cat / K M ble oppnådd som (3,2 ± 0,55) x10 7 M -1 s -1 av SENP1 mot pre-SUMO1, som er i overensstemmelse med generelle enzymatiske kinetikkparametrene. Derfor er denne metodikken gyldig og kan brukes etSA generell tilnærming til å karakterisere andre proteaser også.
Protocol
Discussion
FRET teknologi har blitt brukt til å studere pre-SUMO1 modning av SENP1 9. CFP-YFP ble anvendt som FRET pair og Proporsjonal analyse, som er forholdet av akseptor til donor utslipp, ble brukt til å karakterisere de kinetiske egenskaper. Det er imidlertid ingen behandling av donor og akseptor selvstendig fluorescens i den tradisjonelle Proporsjonal FRET analyse. Forholdet ikke direkte korrelerer med mengden av fordøyd substrat.
Her rapporterer vi en utviklet svært følsomme FRE…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er veldig takknemlig til Victor GJ Rodgers for verdifulle råd. Vi takker alle medlemmer av Liao gruppe for svært nær samarbeid og for å få hjelp med denne studien. Denne studien ble støttet av National Institutes of Health (Grant AI076504 til JL).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 |
| 2xYT | Research Products Internationa.l Corp. | X15600 |
| Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 |
| Coomassie plus (Bradford) Assay Regent | Thermo Scientific | 23238 |
| 384-well plate (glass bottom) | Greiner | 781892 |
| FlexStation II 384 plate reader | Molecular Device |
References
- Johnson, E. S. Protein modification By SUMO. Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes & Development. 18, 2046-2059 (2004).
- Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).
- Müller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. SUMO, ubiquitin’s mysterious cousin. Nature. , 202-210 (2001).
- Hochstrasser, M. SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein. Cell. , 5-8 (2001).
- Drag, M., Salvesen, G. S. DeSUMOylating enzymes-SENPs. IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).
- Mukhopadhyay, D., Dasso, M. Modification in reverse: the SUMO proteases. Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).
- Reverter, D., Lima, C. D. Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).
- Shen, L., et al. SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).
- Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein. Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).
- Mikolajczyk, J., et al. Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs. Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).
- Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes. Biochem. J. , 335-344 (2010).
- Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family. Biochemical Journal. 409, 461 (2008).
- Engels, I. H., et al. A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity. Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).
- Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing. Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).
- Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).
