定量荧光共振能量转移（福斯特共振能量转移）SENP1蛋白酶的动力学测定分析
Summary
涉及的FRET（福斯特共振能量转移）信号的定量分析酶动力学研究的一种新方法。<em> K<sub> M</sub</em>和<em> K<sub>猫</sub</em> SENP1（SUMO / Sentrin特定的蛋白酶1）预SUMO1（小泛素样修饰）的催化结构域的水解获得。这个定量的基于FRET的蛋白酶动力学研究的一般原则可以应用到其他的蛋白酶。
Abstract
可逆的翻译后修饰的蛋白质与泛素或泛蛋白 – 样的蛋白质（Ubls）被广泛地用于动态调节蛋白的活性，并具有在许多生物过程中的各种不同的角色。例如，SUMO共价键修改大量蛋白质的重要角色，在许多细胞过程，包括细胞周期调控，细胞的生存和死亡，DNA损伤反应和应激反应1-5。 SENP，SUMO特异性蛋白酶，成熟的SUMO前体肽链内切酶的功能，或作为isopeptidase删除SUMO从靶蛋白SUMO化循环刷新1,3,6,7。
或特异性的酶的催化效率最好是其特征在于由比率的动力学常数，K 猫 / K M。在几项研究中，的动力学参数的SUMO-SENP对已确定的各种方法，包括基于聚丙烯酰胺凝胶Western-blot检测，RADIOActive的标记底物，荧光化合物或蛋白质标记底物8-13。然而，聚丙烯酰胺凝胶为基础的技术，它使用“本土”的蛋白质，但费力，技术要求高，不容易借给自己详细的定量分析。所得到的K 猫 / K M从使用的四肽或蛋白的研究，与ACC（7 -氨基-4-carbamoylmetylcoumarin）或AMC（7 -氨基-4 -甲基香豆素）荧光团要么达两个数量级低于天然底物或不能明确区分和肽链内切酶的活动SENPs。
最近，基于FRET的蛋白酶检测使用，研究去泛素酶（DUBS）或SENPs的FRET对青色荧光蛋白（CFP），黄色荧光蛋白（YFP）9,10,14,15。受体发射的比率被用作供体发射的定量参数FRET蛋白酶交流信号监视器拉了一的决心。然而，这种方法忽略的信号交叉污染的受体和供体受体和供体荧光发射波长，因而是不准确的。
我们开发了一个新的高度基于FRET的蛋白酶敏感和定量分析，确定动力学参数的SUMO1成熟的SENP1。一种工程FRET对CyPet的和YPet显着提高的FRET效率和荧光量子产率，被用来生成的CyPet（预SUMO1）-YPet基板16。我们差异化和量化的绝对贡献的供体和受体和FRET在接受器和发射波长，荧光信号。得到的k 猫 / K M的值（3.2±0.55）×10 7 M -1 -1 SENP1朝向预SUMO1，这是与一般的酶动力学参数。因此，这种方法是有效的，并可以使用了一个通用的方法来描述以及其他蛋白酶。
Protocol
Discussion
FRET技术用于研究前SUMO1的成熟，由SENP1 9。 CFP-YFP用作FRET对和比例的分析，这是受体捐助排放比，用于表征的动力学性质。然而，有没有考虑供体和受体在传统比例的自身荧光共振分析。比例不直接与衬底消化量。
在这里，我们报告一个高度敏感的基于FRET的的蛋白酶分析研究动力学的前SUMO1的成熟SENP1。对比的比例的方法，从根本上提高一个新的理论方法与共振信号?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们非常感谢维克多GJ罗杰斯宝贵的意见。我们感谢所有的廖组的成员非常密切的合作工作，并帮助这项研究。这项研究是由美国国立卫生研究院（批准AI076504 JL）的支持。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 |
| 2xYT | Research Products Internationa.l Corp. | X15600 |
| Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 |
| Coomassie plus (Bradford) Assay Regent | Thermo Scientific | 23238 |
| 384-well plate (glass bottom) | Greiner | 781892 |
| FlexStation II 384 plate reader | Molecular Device |
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