Kwantitatieve FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analyse voor SENP1 Protease Kinetics Bepaling
Summary
Een nieuwe werkwijze die kwantitatieve analyse van FRET (Förster Resonance Energy Transfer) signalen is beschreven voor het bestuderen enzymkinetiek.<em> K<sub> M</sub</em> En<em> K<sub> Cat</sub</em> Verkregen voor de hydrolyse van het katalytische domein van SENP1 (SUMO / Sentrin specifieke protease 1) een pre-SUMO1 (Small Ubiquitin-like modifier). De algemene beginselen van dit kwantitatieve FRET-gebaseerde protease kinetisch onderzoek kan worden toegepast op andere proteasen.
Abstract
Omkeerbare posttranslationele modificaties van eiwitten met ubiquitine of ubiquitine-achtige eiwitten (Ubls) worden veel gebruikt voor het dynamisch regelen eiwitactiviteit en diverse rollen in vele biologische processen. Zo wijzigt SUMO covalent een groot aantal of eiwitten met een rol in de cellulaire processen, waaronder celcyclus regulering, celoverleving en dood, DNA schade respons, en stressrespons 1-5. SENP als SUMO-specifiek protease, functies als endopeptidase in de rijping van SUMO precursors of een isopeptidase verwijderen SUMO uit de doeleiwitten en vernieuw de SUMOylation cyclus 1,3,6,7.
De katalytische efficiëntie of specificiteit van een enzym best gekenmerkt door de verhouding van de kinetische constanten, kcat / M. In verscheidene studies is de kinetische parameters van SUMO-SENP paren bepaald door verschillende methoden, waaronder polyacrylamide gel gebaseerde western-blot, radIOActive-gemerkt substraat, fluorescerende verbinding of eiwit gemerkt substraat 8-13. De polyacrylamide-gel-gebaseerde technieken, die de "natieve" eiwitten gebruikt, maar zijn omslachtig en technisch zware, die niet verder lenen zich gedetailleerde kwantitatieve analyse. De verkregen kcat / M van studies met tetrapeptiden of eiwitten met ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) of AMC (7-amino-4-methylcumarine) fluorofoor waren ofwel tot twee orden van grootte lager dan de natuurlijke substraten of niet duidelijk onderscheid maken tussen de iso-en endopeptidase activiteiten van SENPs.
Recentelijk FRET gebaseerde protease assays werden gebruikt om de ubiquitinerings enzymen (Dubs) of SENPs bestuderen met het FRET paar cyaan fluorescent eiwit (CFP) en geel fluorescent eiwit (YFP) 9,10,14,15. De verhouding van acceptor emissie van de donor emissie werd gebruikt als kwantitatieve parameter voor FRET signaal monitor voor protease activiteit vastberadenheid. Deze methode signaal kruisbesmettingen genegeerd de acceptor en donor emissie golflengten door acceptor en donor fluorescentie zichzelf en was dus niet nauwkeurig.
We hebben een nieuwe, uiterst gevoelige en kwantitatieve FRET gebaseerde protease assay voor het bepalen van kinetische parameters van pre-SUMO1 volgroeiing door SENP1. Een aangelegde FRET-paar CyPet en YPet met aanzienlijk verbeterde FRET efficiency en fluorescentie kwantumopbrengst, werden gebruikt om de CyPet-(pre-SUMO1)-YPet substraat 16 genereren. We onderscheiden en gekwantificeerd absolute fluorescentiesignalen bijgedragen door de donor en acceptor en FRET de acceptor en emissiegolflengten respectievelijk. De waarde van k cat / K M werd verkregen (3,2 ± 0,55) x 10 7 M-1 s -1 van SENP1 naar pre-SUMO1, hetgeen overeenkomt met de algemene enzymatische kinetische parameters. Daarom is deze werkwijze geldt en kan worden gebruikt eensa algemene aanpak van andere proteasen karakteriseren als goed.
Protocol
Discussion
FRET technologie is gebruikt om vooraf SUMO1 de rijping studie door SENP1 9. CFP-YFP werd gebruikt als FRET-paar en ratiometrische analyse, is de verhouding van donor acceptor aan emissies, werd gebruikt om de kinetische eigenschappen karakteriseren. Er is echter geen rekening gehouden met donor en acceptor zelf fluorescentie in de traditionele ratiometrische FRET analyse. De verhouding niet rechtstreeks verband met de hoeveelheid gedigesteerd substraat.
Hier rapporteren we een on…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn erg dankbaar voor Victor GJ Rodgers voor waardevolle adviezen. Wij danken alle leden van de Liao-groep voor zeer nauwe samenwerking werk en voor hulp bij dit onderzoek. Dit onderzoek werd ondersteund door de National Institutes of Health (Grant AI076504 naar JL).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 |
| 2xYT | Research Products Internationa.l Corp. | X15600 |
| Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 |
| Coomassie plus (Bradford) Assay Regent | Thermo Scientific | 23238 |
| 384-well plate (glass bottom) | Greiner | 781892 |
| FlexStation II 384 plate reader | Molecular Device |
References
- Johnson, E. S. Protein modification By SUMO. Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes & Development. 18, 2046-2059 (2004).
- Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).
- Müller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. SUMO, ubiquitin’s mysterious cousin. Nature. , 202-210 (2001).
- Hochstrasser, M. SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein. Cell. , 5-8 (2001).
- Drag, M., Salvesen, G. S. DeSUMOylating enzymes-SENPs. IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).
- Mukhopadhyay, D., Dasso, M. Modification in reverse: the SUMO proteases. Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).
- Reverter, D., Lima, C. D. Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).
- Shen, L., et al. SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).
- Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein. Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).
- Mikolajczyk, J., et al. Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs. Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).
- Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes. Biochem. J. , 335-344 (2010).
- Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family. Biochemical Journal. 409, 461 (2008).
- Engels, I. H., et al. A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity. Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).
- Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing. Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).
- Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).
