Eine neuartige Methode, die quantitative Analyse von FRET (Förster Resonance Energy Transfer)-Signale für das Studium Enzymkinetik beschrieben.<em> K<sub> M</sub</em> Und<em> K<sub> Cat</sub</em> Wurden zur Hydrolyse der katalytischen Domäne des SENP1 (SUMO / Sentrin spezifische Protease 1) vor SUMO1 (Small Ubiquitin-ähnlicher Modifikator) erhalten. Die allgemeinen Grundsätze dieses quantitative-FRET-basierten Protease kinetische Untersuchung auf andere Proteasen angewendet werden.
Reversible posttranslationale Modifikationen von Proteinen mit Ubiquitin oder Ubiquitin-ähnliche Proteine (UBLs) werden häufig verwendet, um dynamisch zu regulieren Protein-Aktivität und haben diverse Rollen in vielen biologischen Prozessen. Beispielsweise SUMO kovalent modifiziert eine große Anzahl oder Proteine mit wichtige Rollen bei vielen zellulären Prozessen, einschließlich der Zellzyklus-Regulation, Zellüberleben und Tod, DNA-Schädigung Antwort und Stress-Response 1-5. SENP, wie SUMO-spezifische Protease, um Funktionen wie einer Endopeptidase bei der Reifung von SUMO Vorstufen oder als Isopeptidase SUMO von der Zielproteine zu entfernen und Aktualisiere die SUMOylierung Zyklus 1,3,6,7.
Die katalytische Effizienz oder Spezifität eines Enzyms wird am besten durch das Verhältnis der kinetischen Konstanten, k cat / K M gekennzeichnet. In mehreren Untersuchungen haben die kinetischen Parameter von SUMO-SENP paarweise durch verschiedene Verfahren, einschließlich Polyacrylamid Gel-basierten Western-Blot bestimmt worden ist, radIOActive-markiertes Substrat, eine fluoreszierende Verbindung oder Protein markierte Substrat 8-13. Doch die Polyacrylamid-Gel-Techniken, die die "native" Proteine verwendet, aber aufwendig und technisch anspruchsvoll sind, haben die nicht leicht eignen sich für detaillierte quantitative Analyse. Das erhaltene k cat / K M aus Untersuchungen unter Verwendung Tetrapeptiden oder Proteine mit einem ACC-(7-Amino-4-carbamoylmetylcoumarin) oder AMC (7-Amino-4-methylcumarin) Fluorophor waren entweder bis zu zwei Größenordnungen niedriger als die natürlichen Substrate oder kann nicht eine deutliche Differenzierung der iso-und Endopeptidase Aktivitäten SENPs.
Kürzlich FRET-Protease-Tests wurden verwendet, um die Enzyme deubiquitinating (DUBs) oder SENPs mit der FRET-Paar von Cyan Fluorescent Protein (GFP) und gelb fluoreszierendes Protein (YFP) 9,10,14,15 studieren. Das Verhältnis von Akzeptor-Emission um Donoremission wurde als quantitative Parameter verwendet für Signal-Monitor für Protease ac FRETtivität Entschlossenheit. Allerdings ignoriert diese Methode Signal Kreuzkontaminationen bei der Akzeptor und Donor Emissionswellenlängen von Donor-und Akzeptor Eigenfluoreszenz und war somit nicht korrekt.
Wir entwickelten einen neuartigen hochempfindliche quantitative und FRET-Protease Assay zur Bestimmung der kinetischen Parameter von Pre-SUMO1 SENP1 Reifung durch. Gentechnisch FRET-Paar und CyPet YPet mit deutlich verbesserten Wirkungsgrad und FRET Fluoreszenzquantenausbeute, wurden verwendet, um die CyPet-(pre-SUMO1)-YPet Substrat 16 zu erzeugen. Wir differenziert und quantifiziert absolute Fluoreszenz-Signale von der Donor-und Akzeptor beigetragen und FRET an den Akzeptor und Emissionswellenlängen sind. Der Wert von k cat / K M wurde als (3,2 ± 0,55) erhalten x10 7 M -1 s -1 von SENP1 Richtung Pre-SUMO1, die in Übereinstimmung mit den allgemeinen enzymatischen kinetischen Parameter ist. Daher ist diese Methode gültig und kann verwendet werden, einsa allgemeinen Ansatz auf andere Proteasen sowie charakterisieren.
FRET-Technologie verwendet wurde, um die Pre-SUMO1 SENP1 Reifung von 9 studieren. GFP-YFP wurde als FRET-Paar und ratiometrische Analyse, die das Verhältnis von Akzeptor zu Donor Emissionen verwendet, wurde verwendet, um die kinetischen Eigenschaften charakterisieren. Es besteht jedoch keine Berücksichtigung von Donor und Akzeptor Eigenfluoreszenz im herkömmlichen ratiometrische FRET-Analyse. Das Verhältnis nicht direkt mit der Menge an verdauten Substrat korrelieren.
Hier ber…
The authors have nothing to disclose.
Wir sind sehr dankbar, dass Victor GJ Rodgers für wertvolle Ratschläge. Wir danken allen Mitgliedern der Liao-Gruppe für sehr enge gemeinsame Arbeit und für die Hilfe bei dieser Studie. Diese Studie wurde von den National Institutes of Health (Grant AI076504 JL) unterstützt.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 |
2xYT | Research Products Internationa.l Corp. | X15600 |
Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 |
Coomassie plus (Bradford) Assay Regent | Thermo Scientific | 23238 |
384-well plate (glass bottom) | Greiner | 781892 |
FlexStation II 384 plate reader | Molecular Device |