Quantitativa FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Análise para SENP1 Determinação Cinética Protease
Summary
Um novo método que envolve a análise quantitativa de FRET (Förster Resonance Energy Transfer) sinais é descrito para o estudo de cinética enzimática.<em> K<sub> M</sub</em> E<em> K<sub> Gato</sub</em> Foram obtidos por hidrólise do domínio catalítico de SENP1 (SUMO / Sentrin protease específica 1) para pré-SUMO1 (modificador ubiquitina-like Pequeno). Os princípios gerais deste estudo cinético quantitativo-FRET baseada protease pode ser aplicado a outras proteases.
Abstract
Reversíveis modificações pós-tradução de proteínas com proteínas ubiquitina ou ubiquitina-like (Ubls) são amplamente usados para regular a actividade da proteína de forma dinâmica e têm diversos papéis em diversos processos biológicos. Por exemplo, SUMO covalentemente modifica um grande número de proteínas ou com papéis importantes em muitos processos celulares, incluindo a regulação do ciclo celular, sobrevivência e morte celular, resposta a danos no ADN, e resposta ao estresse 1-5. SENP, como SUMO-protease específico, funciona como uma endopeptidase na maturação dos precursores SUMO ou como uma isopeptidase para remover SUMO de proteínas-alvo e refrescar o ciclo SUMOilação 1,3,6,7.
A eficiência catalítica ou especificidade de uma enzima é melhor caracterizada por a razão entre as constantes cinéticas, k cat / K M. Em diversos estudos, os parâmetros cinéticos da SUMO-SENP pares foram determinadas por vários métodos, incluindo em gel de poliacrilamida-based western-blot, radIOActive marcado com composto de substrato, fluorescente ou proteína marcada substrato 8-13. No entanto, as técnicas de gel de poliacrilamida-base, que utilizaram os "nativos" proteínas, mas são trabalhosos e tecnicamente exigente, que não se prestam facilmente à análise quantitativa detalhada. A obtido k cat / K M a partir de estudos que utilizam tetrapéptidos ou proteínas com um ACC (ácido 7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) ou AMC (7-amino-4-metilcumarina) fluoróforo ou eram até duas ordens de grandeza mais baixa do que os substratos naturais ou não pode diferenciar claramente as iso-endopeptidase e atividades de SENPs.
Os ensaios de protease recentemente, FRET base foram utilizados para estudar as enzimas deubiquitinating (Dubs) ou SENPs com o par FRET de proteína fluorescente ciano (PCP) e proteína fluorescente amarela (YFP) 9,10,14,15. A proporção de emissão de aceitador para emissão de dador foi utilizado como parâmetro quantitativo para FRET monitor de sinal para a protease acdade determinação. No entanto, este método ignorado sinal contaminações cruzadas, no comprimento de onda de emissão de aceitador e dador de aceitador e dador de auto-fluorescência e, portanto, não era correcto.
Desenvolveu-se um novo ensaio altamente sensível e quantitativo da protease FRET com base para a determinação dos parâmetros cinéticos de uma pré-maturação por SUMO1 SENP1. Um par de engenharia FRET CyPet e YPet melhorou significativamente a eficiência com FRET e rendimento quântico de fluorescência, foram utilizadas para gerar o CyPet (pré-SUMO1)-substrato YPet 16. Nós diferenciados e quantificados absolutos sinais de fluorescência contribuídos pelo dador e aceitador FRET e nos comprimentos de onda de emissão e de aceitador, respectivamente. O valor de k cat / K M foi obtido como (3,2 ± 0,55) x10 7 M -1 s -1 de SENP1 para pré-SUMO1, o que está de acordo com os parâmetros cinéticos enzimáticos gerais. Assim, este método é válido e pode ser utilizado umsa geral aproximar para caracterizar outras proteases bem.
Protocol
Discussion
FRET tecnologia tem sido utilizada para estudar a maturação de pré-SUMO1 por SENP1 9. CFP-YFP foi utilizado como o par de FRET e análise raciométrica, que é a relação entre as emissões de aceitador de doadores, foi utilizada para caracterizar as propriedades cinéticas. No entanto, não há qualquer consideração de dador e aceitador de auto-fluorescência na raciométrica tradicional FRET análise. A relação não é directamente correlacionada com a quantidade de substrato digerido.
<p class=…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos muito gratos a Victor GJ Rodgers para o conselho valioso. Agradecemos a todos os membros do grupo de Liao de muito perto o trabalho colaborativo e para ajudar com este estudo. Este estudo foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (Grant AI076504 a JL).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 |
| 2xYT | Research Products Internationa.l Corp. | X15600 |
| Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 |
| Coomassie plus (Bradford) Assay Regent | Thermo Scientific | 23238 |
| 384-well plate (glass bottom) | Greiner | 781892 |
| FlexStation II 384 plate reader | Molecular Device |
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