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Biology

冻结人类胚胎干细胞

doi: 10.3791/50 Published: October 12, 2006

Summary

在这里,我们证明了我们的实验室如何冻结色调人类胚胎干细胞系。

Abstract

在这里,我们证明了我们的实验室如何冻结色调人类胚胎干细胞系。一个健康,成倍扩大培养,用PBS洗,以去除残留的媒体,否则可能淬火胰蛋白酶反应。回暖的0.05%胰蛋白酶EDTA,然后添加到覆盖细胞,板允许在室温下5分钟孵化。在这段时间内可以观察细胞四舍五入,和殖民地抬离板面。温和的反复吹打将删除从钢板表面的细胞和殖民地。放置在一个标准的锥形管,包含预热的胚胎干细胞媒体淬火剩下的胰蛋白酶,胰酶消化细胞,然后纺制。细胞悬浮在大约一百万个细胞的浓度生长介质,在一个媒体毫升,浓度等,一个冻结等分足够的复活一种文化上10厘米板。充分重悬细胞后,冰冷的冻结媒体是在同等体积增加。细胞悬浮液充分混合,分装成冷冻小瓶,允许慢慢冻结超过24小时- 80C。冷冻细胞可以长期贮存的液氮转移到气相,或约6个月保持在-80。

Protocol

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  1. 一个健康,成倍扩大培养,用PBS洗,以去除残留的媒体,否则可能淬火胰蛋白酶反应。
  2. 回暖的0.05%胰蛋白酶EDTA,然后添加到覆盖细胞,板允许在室温下5分钟孵化。在这段时间内可以观察细胞四舍五入,和殖民地抬离板面。
  3. 温和的反复吹打将删除从钢板表面的细胞和殖民地。
  4. 放置在一个标准的锥形管,包含预热的胚胎干细胞媒体淬火剩下的胰蛋白酶,胰酶消化细胞,然后纺制。
  5. 细胞悬浮在大约一百万个细胞的浓度在媒体中的生长介质。
  6. 充分重悬细胞后,冰冷的冻结媒体在相同体积的增加。
  7. 细胞悬浮液充分混合,分装成冷冻小瓶,允许慢慢冻结超过24小时- 80C。
  8. 冷冻细胞可以长期贮存的液氮转移到气相,或约6个月保持在-80。

注:在106细胞/ ml的浓度冷冻等分足够的复活一种文化上10厘米板。

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Discussion

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冻结色调细胞株中描述的技术,我们有效地存储和复活的色调细胞株和利益的任何哺乳动物细胞。工作时,与胚胎干细胞系,染色体核型异常,可能会出现不正常的细胞可以迅速接管该行,冷冻的细胞在每一个通道的一小部分是一个重要的考虑因素。因此,有冷冻分割在某些段落中除了大银行,在每一个通道是非常可取的。

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
HuES Medium medium For a total of 651.5 mL, add: 500 mL KO-DMEM + 6.5 mL PenStrep + 6.5 mL L-Glut + 6.5 mL NEAA 6.5 mL + beta-mercapt–thanol 0.6 µL (14.3 M stock) + 65 mL Serum Replacement + 65 mL Plasmanate + 0.65 mL bFGF2 (~10 ng/mL final)
Freezing Medium medium 80% FCS (fetal calf serum) + 20% DMSO (dimethyl sulfoxide). Stored at 4 °C.

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References

  1. Forthcoming.
冻结人类胚胎干细胞
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Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Freezing Human ES Cells. J. Vis. Exp. (1), e50, doi:10.3791/50 (2006).More

Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Freezing Human ES Cells. J. Vis. Exp. (1), e50, doi:10.3791/50 (2006).

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