Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

التدرج الكثافة متعدد الطبقات البلمرة (DGMP): تقنية جديدة لإنشاء موضوع متعدد المقصورة، السقالات للهندسة الأنسجة تخصيص

doi: 10.3791/50018 Published: February 12, 2013

Summary

نحن هنا وصف استراتيجية فريدة من نوعها لخلق حيويا، المصفوفات الطبقات مع واجهات المستمر بين طبقات متميزة لهندسة الأنسجة. يمكن لهذه السقالة توفير بيئة مثالية للتخصيص لتعديل سلوك الخلية عن طريق إشارات مختلفة البيولوجية أو الكيميائية أو الميكانيكية

Abstract

ومصفوفات معقدة زراعة الأنسجة، في أي نوع من أنواع وتركيزات من المحفزات البيولوجية (مثل عوامل النمو، ومثبطات، أو جزيئات صغيرة) أو هيكل المصفوفة (على سبيل المثال تكوين، والتركيز، أو صلابة من المصفوفة) تختلف على الفضاء، وتمكين طائفة واسعة من التحقيقات بشأن كيفية هذه المتغيرات تؤثر تمايز الخلايا، والهجرة، وغيرها من الظواهر. التحدي الرئيسي في خلق مصفوفات الطبقات والحفاظ على السلامة الهيكلية واجهات طبقة دون انتشار المكونات الفردية من كل طبقة 1. المنهجيات الحالية لتحقيق ذلك ما يلي photopatterning 2-3، الطباعة الحجرية functionalization5 متتابعة، وتجميد التجفيف على microfluidics أو الطرد المركزي العديد من الأجهزة المتطورة التي تتطلب والمهارات التقنية. الاعتماد على الآخرين المرفقات من طبقات متتابعة الفردية، والتي قد تؤدي إلى طبقات التبطين 9

DGMP يتغلب على هذه القضايا باستخدام معدل كثافة خاملة مثل iodixanol لخلق طبقات متفاوتة من الكثافة 10. يمكن أن تكون مختلطة منذ المعدل الكثافة مع أي سابق البلمرة أو جزيء النشطة بيولوجيا، DGMP يسمح تخصيص كل طبقة سقالة. ببساطة تركيز متفاوتة من معدل الكثافة يمنع الاختلاط بين الطبقات المجاورة في حين أنها لا تزال مائي. البلمرة اللاحقة خطوة واحدة يؤدي إلى سقالة متعددة الطبقات المستمر هيكليا، والذي لديه كل طبقة متميزة الكيميائية والخواص الميكانيكية. يمكن المعدل الكثافة إزالتها بسهولة مع الشطف كافية دون اضطراب من طبقات الفردية أو مكوناتها. ولذلك هذه التقنية مناسبة تماما لخلق الهلاميات المائية من مختلف الأحجام والأشكال والمواد.

ويرد على بروتوكول للافتعال 2D-البولي ايثيلين جلايكول (PEG) هلام، في أي الطبقات بالتناوب دمج RGDS-350، أدناه. نستخدم PEG بecause من حيويا والخاملة. يستخدم RGDS، والتصاق الخلايا الببتيد 11، لإثبات تقييد المكاني للجديلة البيولوجية، واقتران من fluorophore (اليكسا فلور 350) تمكننا من التمييز بين الطبقات المختلفة بصريا. ويمكن تكييف هذا الإجراء لمواد أخرى (مثل الكولاجين، hyaluronan، الخ) ويمكن تمديدها لصنع المواد الهلامية 3D مع بعض التعديلات 10.

Protocol

1. توليف fluorescently المسمى Acryloyl-PEG-RGDS

  1. الرد على الببتيد RGDS مع استر كاربوكسيميثيل acryloyl-PEG-succinimidyl (aPEG-SCM، PEG MW: 3400 جم / مول) وdiisopropylethylamine NN (DIPEA) في نسب 1.2:1:2 الرحى في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) تحت الأرجون في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
  2. تأكيد اقتران بواسطة مصفوفة بمساعدة وقت الامتزاز / التأين الليزر الطيران (TOF MALDI-) مطياف الكتلة. إضافة 1 ميكرولتر من محلول التفاعل aPEG-RGDS إلى بقعة العينة على الهدف MALDI والجافة. إعداد محلول مشبع من MALDI العالمي مصفوفة في رباعي هيدرو الفوران (THF) ودوامة لمدة 1 دقيقة. إضافة ~ 1 ميكرولتر من هذا الحل الى مكان الحادث نفس العينة. كرر الإجراء aPEG-SCM للمقارنة. تحميل وتحليلها. يجب أن الوزن الجزيئي للaPEG-RGDS تكون أكبر من aPEG-SCM (الشكل 2).
  3. لالمتقارن على fluorophore، إضافة مبلغ متساوي المولية للحمض فلور اليكسا 350 الكربوكسيلية (succinimydyl استر)، حلفي الحد الأدنى من حجم DMSO، إلى محلول التفاعل aPEG-RGDS من 1.1 والرد تحت الأرجون في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
  4. تنقية aPEG-RGDS-350 من dialyzing (MW 3500 دا) ضد O 2 H DI-C ° 4 في مدة 48 ساعة في نسبة 1،000:1 الحجمي، وتبادل ديالة على الأقل مرتين في اليوم الواحد.
  5. تجميد تجفيف تنقية aPEG-RGDS-350 في المنطقة الحرة بالإضافة إلى Labconco أو ما يعادلها نظام تجميد الجافة ومخزن في -20 ° C.

2. إعداد قالب 2D وتصنيع مادة هلامية PEG 2D بالتناوب مع الطبقات RGDS-350

  1. إعداد الشرائح الزجاجية مسعور. وضع الشرائح الزجاجية النظيفة في طبق فرن الزجاج في فراغ. الحرارة إلى 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة حتى يجف تماما السطوح. مكان الطبق مع شرائح الموجودة في غطاء الدخان وإضافة 250 ميكرولتر Sigmacote إلى كل شريحة، هزاز بلطف لمدة 30 ثانية إلى سطح طبقة بأكملها. شطف جيدا الشرائح المغلفة مع الميثانول بنسبة 100٪، تليها الغسيل في الماء المقطر، تمرغ مرتين لمدة 5 دقائق في LEAS فير 10 مل.
  2. قطع الفواصل سيليكون (0.8 مم) مع 10 ملم خزعة اللكمات.
  3. الأوتوكلاف الفواصل سيليكون والشرائح الزجاجية Sigmacote المعاملة.
  4. وضع حلول لكل طبقة منها في أنابيب microfuge الفردية عن طريق خلط diacrylate PEG (PEGda) السلائف (تركيز النهائي 15٪ ث / ت) مع كميات مختلفة من iodixanol (60٪ محلول في الماء) لانتاج تركيزات متفاوتة النهائي (على سبيل المثال 40٪، 30٪، 20٪ و 10٪)، المكمل لحجم المتبقية مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) للحصول على الحلول للكثافات متدرج. بطريقة مماثلة، لطبقات متبادلة، مزيج aPEG-RGDS-350 (تركيز النهائي 8 ملم) مع iodixanol وPBS لانتاج تركيزات مختلفة (على سبيل المثال 35٪، 25٪، و 15٪).
  5. إضافة photoinitiator (2-هيدروكسي 4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone، والأوراق المالية في 333mg/ml N-الفينيل pyrrolidone) لكل حل لمختلف الطبقات (10 ميكرولتر من محلول المخزون في كل مل من محلول طبقة). أنا Photoinitiatorوأضاف ق الماضي لمنع البلمرة قبل طبقات من المواد الهلامية في القالب، كما أنه حساس للضوء.
  6. سيتم تنفيذ الخطوات اللاحقة من هذا البروتوكول في خزانة السلامة البيولوجية لضمان العقم.
  7. فلتر تعقيم كل حل معقمة باستخدام حقنة 1 مل و 0.2 ميكرومتر التصفية. تجميع الإعداد قالب من يقحم التبادل بين شريحتين من الزجاج Sigmacore المعالجة وآمنة مع وضع المشابك كما هو مبين في الشكل 1.
  8. يلقي المواد الهلامية الطبقات بإضافة الحل الأكثر كثافة (على سبيل المثال PEGda مع iodixanol 40٪) أولا، تليها حلا أقل كثافة (على سبيل المثال، aPEG RGDS-350 مع iodixanol 35٪). تكرار طبقات بديلة لتحقيق عدة طبقات من تكوين وكثافة المطلوب كما هو مبين في الشكل 1.
  9. أشرق ضوء مقلب مع نانومتر 365 لل3 دقائق باستخدام الأشعة فوق البنفسجية المحمولة-9000 مصباح. السماح للبلمرة المواد الهلامية لعلاج لمدة 5 دقائق. إزالة المشابك، ثم رفع بلطف الزجاج الأعلى الشريحة والعفن و؛ فإن المواد الهلامية DGMP الطبقية لا تزال على الشرائح. باستخدام ملعقة معقمة، ضع بعناية المواد الهلامية في أنبوب 50 مل تحتوي على معقمة PBS أو مستنبت للغسيل.
  10. غسل المواد الهلامية في بلمرة PBS في نسبة 1،000:1 الحجمي، وتبادل عازلة على الأقل مرتين في اليوم لإزالة معدل الكثافة، photoinitiator، والبوليمر غير المتفاعل. وبدلا من ذلك، يمكن تبادل PBS مع نمو الخلايا المتوسطة. تخزين المواد الهلامية في DGMP PBS أو متوسطة النمو للخلية تجربة الثقافة موضح في الخطوة 3.
  11. لتصور طبقات بالتناوب، وترتيب DGMP هلام (جل هذه لن تكون قابلة للاستخدام للثقافة الخلية) على طول المسطرة في علبة عينة من الوثائق VersaDoc حدة هلام. كشف المواد الهلامية في 350 نانومتر، وزمن التعرض سوف تختلف تبعا للتركيز fluorophore. بالتناوب عصابات الظلام والأزرق في هيدروجيل DGMP تثبت تشكيل طبقات منفصلة من التركيب الكيميائي متميزة (الشكل 3).

"jove_title"> 3. 2D زراعة الخلايا على الهلام DGMP

  1. لدمج المواد الهلامية RGDS الببتيد، استخدام الخلايا التصاق التابعة، مثل C2C12 myoblasts.
  2. إدراج بلطف المواد الهلامية DGMP (المخزنة في PBS) في الآبار من 48 لوحات جيدة زراعة الخلايا باستخدام مكشطة الخلية معقمة في خزانة السلامة الأحيائية.
  3. قبل الدافئة المتوسطة النمو (وسط Dulbecco لتعديل النسر أو DMEM تستكمل مع مصل الجنين 10٪ V / V الأبقار و 1٪ V / V 100X حل البنسلين الستربتوميسين) وPBS في حمام مائي وضعت في 37 ° C.
  4. غسل لوحة 60٪ متموجة (10 ملم) من C2C12 الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. نضح قبالة PBS الحصاد والخلايا عن طريق إضافة 1 مل من التربسين 0.25٪ واحتضان EDTA-C ° 37 في لمدة 2 دقيقة. إعادة تعليق الخلايا في النمو والمتوسطة خلايا العد. البذور التي تحتوي على هلام DGMP زراعة الخلايا بشكل جيد مع C2C12 myoblasts (20،000 خلية / سم 2). احتضان الخلايا في C ° 37٪ CO في 5 2 / الرطوبة النسبية 95٪. متوسطة بلطف تبادل بعد 4 ساعة، الحرص على عدم إعادةنقل الخلايا برفق الالتزام.
  5. بعد 24 ساعة، قد أكدت الحجز على C2C12 myoblasts على الطبقات التي تحتوي على RGDS من المواد الهلامية التي كتبها DGMP epifluorescence ومرحلة المجهر النقيض (زايس Axiovert 200).

Representative Results

MALDI-TOF التحليل يؤكد اقتران من الببتيد RGDS لacryloyl-PEG (الشكل 2). هلام التصوير يكشف بالتناوب RGDS-350 (الأزرق) بعد بلمرة ضوئية المنشأ طبقات (الشكل 3A). كما هو مبين في الشكل 3A، يمكن أن تتفاوت 2D حجم هلام DGMP يعتمد على القطر من قوالب السيليكون (10 مم، اليسار و 8 مم، الحق)، وبالتالي فهي قابلة للتخصيص بسهولة لاستخدامها في فحوصات متعددة - في هذه الحالة لتتناسب مع 48 لوحة جيدا زراعة الخلايا (الشكل 3B). وEpifluorescence المرحلة المجهر النقيض من C2C12 myoblasts مثقف على هلام DGMP يبين المرفق انتقائية على RGDS-350-تحتوي على طبقات PEG (الشكل 4)، مما يدل على تجزئة الخلية التصاق الببتيد (RGDS).

الشكل 1
الشكل 1. الجزيئية weigHT-MALDI تحليل TOF مقارنة aPEG-SCM لaPEG-RGDS تم الحصول عليها بعد الاقتران من الببتيد RGDS.

الشكل 2
الشكل 2. التمثيل التخطيطي لتصنيع هلام DGMP. بعد أن يتم الطبقات والتدرجات، يمكن أن يسمح لهم لتسوية لفترات زمنية مختلفة (ر ق) لإنشاء واجهات تخرج، تليها بلمرة ضوئية المنشأ. ويمكن استخراج طبقات الهلام DGMP بسهولة من القالب لاستخدامها مرة أخرى. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 3
الشكل 3. تصوير A) جل متعدد الطبقات 2D تم الحصول عليها بعد بلمرة ضوئية المنشأ باستخدام 350 نانومتر والقنوات الضوء الأبيض من العكسثيقة وحدة جل الوثائق. تدرج الرمادي صورة تكشف طبقات متبادلة تحتوي على RGDS باللون الأبيض. B) الإدراج من هلام DGMP إلى جانب 48-الأطباق ثقافة الخلية.

الشكل 4
الشكل 4. مدموجة النقيض المرحلة وصورة من epifluorescence C2C12 myoblasts نمت على المواد الهلامية DGMP (مقياس بار 50 ميكرومتر).

الشكل 5
الشكل 5. تأثير على مرونة iodixanol سطح هلام. المجهري القوة الذرية قياسات للعينات ثابتة من ركائز PEG crosslinked باستخدام أساليب المحددة سابقا مع مشغل 2 ن ن القوة 12. * p <0.05 و ** p <0.01.

Discussion

DGMP هي استراتيجية بسيطة لإعداد المواد الهلامية التي متعدد الطبقات لا تعتمد على الأجهزة باهظة الثمن. ويمكن تكييف هذا البروتوكول لإنشاء السقالات باستخدام مواد حيويا الأخرى، مثل الكولاجين وحمض الهيالورونيك. النشطة بيولوجيا الجزيئات الصغيرة، على سبيل المثال خلية التصاق المعززة للRGDS الببتيد، يمكن مصطفة على البوليمر لمنع اختلاط بين طبقات العظة. يمكن تغليف البروتينات في طبقات متميزة دون الحاجة لتصريف المواد الكيميائية لأنها، تبعا لحجم فتحات الشباك مصفوفة، هي أقل عرضة للنشر من خلال الهلاميات المائية 10. المستخدمة هنا نحن iodixanol (Nycoprep)، وهو معدل كثافة خاملة، والتي سبق استخدامها في تطبيقات خلايا قابلة للحياة. ويمكن أيضا معدلات الكثافة أخرى مثل السكروز وسكر العنب يمكن استخدامها. من خلال تغيير الوقت تسوية (ر ق)، ويمكن للمرء أن ضبط واجهات بين طبقتين لإنتاج الانتقال السلس الحاد أو حسب الحاجة (مرة يعطي سلاسة تسوية تعد التحولات) <سوب> 10. على سبيل المثال، يمكن أن تستخدم أكثر سلاسة الانتقال بين طبقات هلام DGMP لإنشاء الانحدار المستمر لجديلة البيولوجية لدراسة عمليات الخلية مثل الكيميائي.

يظهر تأثير معدل الكثافة على تصلب هلام في الشكل (5) لهلام aPEGda 15٪؛ توصيف أكثر اكتمالا من الصلابة والمسامية بوصفها وظيفة من وتركيزات PEGda iodixanol يجري حاليا تقييمها. في حين أن تركيز PEGda في هذا المثال مرتفع نسبيا، لاحظنا ومعامل مرونة أكبر 60٪ في المواد الهلامية مع iodixanol 30٪ مقارنة مع المواد الهلامية دون. ويمكن تعديل التغيير في تصلب هلام عليها تحوير أو تركيز macromer الكثافة يشابك.

لقد طبقنا أيضا تقنية DGMP لخلق 3D باستخدام المواد الهلامية متعدد الطبقات بولكرلميد والسلائف PEG 10. تركيز متفاوتة أو درجة يشابك من سابق البلمرة يسمح التباين في الهيكليةالسقالات، والتي يمكن استخدامها لاستكشاف السلوك الخلية مثل النمو والهجرة الاستقطاب في 3D.

وخلاصة القول، DGMP هو أسلوب للتكيف التي يمكن تطبيقها على افتعال السقالات 2D و 3D من مجموعة متنوعة من المواد حيويا لمجموعة واسعة من التطبيقات والبحوث الطبية الحيوية الأساسية.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم مصالح متضاربة الكشف.

Acknowledgments

الكتاب ممتنون للدعم من الجوائز NIH المدير الجديد المبتكر (1DP2 OD006499 AA-01 لو1DP2 OD006460-01 لAJE)، ومدينة الملك عبد العزيز للعلوم والتقنية (جامعة كاليفورنيا في سان دييغو مركز التميز في لطب النانوي). نود أن نشكر السيدة جيسيكا مور على تعليقاتها الهامة على المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyethylene glycol succinimydyl carboxymethyl (a-PEG-SCM) Laysan 120-64
Polyethelyene glycol diacrylate (PEGda) Dajac Labs 9359
Arginine-Glycine-Aspartic acid-Serine (RGDS) American Peptide 49-01-4
N,N- Diisopropylethylamine (DIPEA) Sigma D125806
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2438
N,N- dimethylformamide (DMF) Fisher D119-4
Tetrahydrofuran (THF) Fisher T397
Dialysis cassette (3500 Da) Thermo Scientific 66330
Alexa Fluor 350 carboxylic acid succinimydyl ester Life Technologies A-10168
Sigmacote Sigma SL2
Silicone spacers Grainger 1MWA4
Biopsy punches Acuderm P1025 (10 mm)
P850 (8 mm)
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Hyclone SH30028
Iodixanol (NycoPrep) Fisher NC9388846
2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone Sigma 410896
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) Life Technologies 11054
Fetal bovine serum Life Technologies 10082
Penicillin-streptomycin Life Technologies 15140
C2C12 myoblasts ATCC CRL-1772
MALDI Bruker N/A
UVR-9000 Bayco UVR-9000
VersaDoc Bio-Rad N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Place, E. S., Evans, N. D., Stevens, M. M. Complexity in biomaterials for tissue engineering. Nat. Mater. 8, 457-470 (2009).
  2. Liu, V. A., Jastromb, W. E., Bhatia, S. N. Engineering protein and cell adhesivity using PEO-terminated triblock polymers. J. Biomed. Mater. Res. 60, 126-134 (2002).
  3. Sharma, B., et al. Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage. Tissue Eng. 13, 405-414 (2007).
  4. Hahn, M. S., et al. Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels. Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).
  5. Kizilel, S., Sawardecker, E., Teymour, F., Perez-Luna, V. H. Sequential formation of covalently bonded hydrogel multilayers through surface initiated photopolymerization. Biomaterials. 27, 1209-1215 (2006).
  6. Harley, B. A., et al. Design of a multiphase osteochondral scaffold. II. Fabrication of a mineralized collagen-glycosaminoglycan scaffold. J. Biomed. Mater. Res. A. 92, 1066-1077 (2010).
  7. Cuchiara, M. P., Allen, A. C., Chen, T. M., Miller, J. S., West, J. L. Multilayer microfluidic PEGDA hydrogels. Biomaterials. 31, 5491-5497 (2010).
  8. Roam, J. L., Xu, H., Nguyen, P. K., Elbert, D. L. The formation of protein concentration gradients mediated by density differences of poly(ethylene glycol) microspheres. Biomaterials. 31, 8642-8650 (2010).
  9. Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures. J. Biomed. Mater. Res. A. 85, 611-618 (2008).
  10. Karpiak, J. V., Ner, Y., Almutairi, A. Density gradient multilayer polymerization for creating complex tissue. Adv. Mater. 24, 1466-1470 (2012).
  11. Pierschbacher, M. D., Ruoslahti, E. Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule. Nature. 309, 30-33 (1984).
  12. Kaushik, G., Fuhrmann, A., Cammarato, A., Engler, A. J. In Situ Mechanical Analysis of Myofibrillar Perturbation and Aging on Soft, Bilayered Drosophila Myocardium. Biophysical Journal. 101, 2629-2637 (2011).
التدرج الكثافة متعدد الطبقات البلمرة (DGMP): تقنية جديدة لإنشاء موضوع متعدد المقصورة، السقالات للهندسة الأنسجة تخصيص
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Joshi-Barr, S., Karpiak, J. V., Ner, Y., Wen, J. H., Engler, A. J., Almutairi, A. Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (72), e50018, doi:10.3791/50018 (2013).More

Joshi-Barr, S., Karpiak, J. V., Ner, Y., Wen, J. H., Engler, A. J., Almutairi, A. Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (72), e50018, doi:10.3791/50018 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter