Her beskriver vi en unik strategi for at skabe biokompatible, lagdelte matricer med kontinuerlige grænseflader mellem distinkte lag for tissue engineering. Et sådant stillads kunne give et ideelt tilpasselig miljø at modulere celle adfærd ved forskellige biologiske, kemiske eller mekaniske signaler
Komplekse vævskulturplader matricer, hvori typer og koncentrationer af biologiske stimuli (f.eks vækstfaktorer, inhibitorer, eller små molekyler) eller matrix struktur (f.eks sammensætning, koncentration eller stivheden af matricen) varierer over rummet, vil muliggøre en lang række undersøgelser om, hvordan disse variabler påvirker celledifferentiering, migration og andre fænomener. Den største udfordring i at skabe lagdelte matricer er at opretholde den strukturelle integritet af lag grænseflader uden diffusion af individuelle komponenter fra hvert lag 1. Aktuelle metoder til at opnå dette omfatter photopatterning 2-3, litografi 4, sekventiel functionalization5, frysetørring 6, MicroFluidics 7, eller centrifugering 8, hvoraf mange kræver avanceret instrumentering og tekniske færdigheder. Andre er afhængige af sekventiel fastgørelse af enkelte lag, som kan føre til delaminering af lagene 9 </sup>.
DGMP overvinder disse problemer ved at anvende en inert densitetsmodifikatoren såsom iodixanol at skabe lag af varierende tætheder 10. Eftersom densitetsmodifikatoren kan blandes med enhver præpolymer eller bioaktive molekyle, DGMP tillader hvert stillads lag, der skal tilpasses. Simpelthen at variere koncentrationen af densitetsmodifikatoren forhindrer blanding af tilstødende lag, mens de forbliver vandigt. Efterfølgende enkelt trin polymerisation giver anledning til en strukturelt kontinuerlig flerlags stillads, hvor hvert lag har særskilte kemiske og mekaniske egenskaber. The densitetsmodifikatoren kan let fjernes med tilstrækkelig skylning uden perturbation af de individuelle lag eller komponenter. Denne teknik er således velegnet til at skabe hydrogeler af forskellige størrelser, former og materialer.
En protokol til fremstilling af en 2D-polyethylenglycol (PEG) gel, hvori skiftende lag omfatte RGDS-350, er skitseret nedenfor. Vi anvender PEG because det er biokompatibelt og inert. RGDS, en celleadhæsion peptid 11, anvendes til at påvise rumlig begrænsning af en biologisk cue, og konjugeringen af en fluorophor (Alexa Fluor 350) giver os mulighed for visuelt at skelne forskellige lag. Denne fremgangsmåde kan tilpasses til andre materialer (fx collagen, hyaluronan, osv.) og kan udvides til fremstilling af 3D-geler med nogle ændringer 10.
DGMP er en simpel strategi for at forberede flerlags geler, der ikke er afhængige af dyre instrumenter. Denne protokol kan tilpasses til at skabe stilladser med andre biokompatible materialer, såsom collagen og hyaluronsyre. Bioaktive små molekyler, for eksempel celleadhæsion-fremmende RGDS peptid, der kan bindes til polymermatrixen at forhindre blanding af signaler mellem lagene. Proteiner kan være indkapslet i distinkte lag uden behov for kemisk konjugation, som de, afhængigt af matrix maskestørrelse, er mindre tilbøjelige til at diffundere gennem hydrogeler 10. Her anvendte vi iodixanol (Nycoprep), en inert densitetsmodifikatoren, som tidligere er blevet anvendt til levedygtige celler applikationer. Andre densitet modifikatorer, såsom saccharose og dextrose kan også anvendes. Ved at variere indsvingningstid (t s), kan man finjustere grænsefladerne mellem to lag til at producere glatte eller skarpe overgange efter behov (længere indsvingningstid giver glattere overgange) <sup> 10. For eksempel kan blødere overgange mellem DGMP gellag anvendes til at frembringe en kontinuert gradient af en biologisk cue at studere celle processer såsom kemotaxis.
Virkningen af densitetsmodifikatoren på gel stivhed er vist i figur 5 til 15% aPEGda gel, en mere komplet karakterisering af stivhed og porøsitet som en funktion af PEGda og iodixanol koncentrationer undersøges i øjeblikket. Mens PEGda koncentration i dette eksempel er relativt høj, observerede vi en 60% større elasticitetsmodul i geler med 30% iodixanol forhold til geler uden. Ændringen i gel stivhed kan justeres ved at modulere den makromere koncentration eller tværbindingsdensitet.
Vi har også anvendt den DGMP teknik til at skabe 3D flerlags geler ved hjælp af polyacrylamid og PEG forstadier 10. Variere koncentrationen eller graden af tværbinding af den præpolymere giver strukturel variation istilladser, som kan anvendes til at undersøge celle-adfærd såsom polariseret vækst og migrering i 3D.
Sammenfattende er DGMP en tilpasningsdygtig teknik, der kan anvendes til fremstilling af 2D-og 3D stilladser fra en række forskellige biokompatible materialer til en lang række biomedicinske og grundforskning applikationer.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er taknemmelige for støtte fra NIH direktørens Nye Innovator Awards (1DP2 OD006499-01 til AA og 1DP2 OD006460-01 til AJE), og Kong Abdulaziz City for videnskab og teknologi (UC San Diego Center of Excellence i nanomedicin). Vi vil gerne takke Ms Jessica Moore for hendes kritiske kommentarer til manuskriptet.
Reagent or Instrument | Company | Catalogue number |
Polyethylene glycol succinimydyl carboxymethyl (a-PEG-SCM) | Laysan | 120-64 |
Polyethelyene glycol diacrylate (PEGda) | Dajac Labs | 9359 |
Arginine-Glycine-Aspartic acid-Serine (RGDS) | American Peptide | 49-01-4 |
N,N– Diisopropylethylamine (DIPEA) | Sigma | D125806 |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2438 |
N,N- dimethylformamide (DMF) | Fisher | D119-4 |
Tetrahydrofuran (THF) | Fisher | T397 |
Dialysis cassette (3500 Da) | Thermo Scientific | 66330 |
Alexa Fluor 350 carboxylic acid succinimydyl ester | Life Technologies | A-10168 |
Sigmacote | Sigma | SL2 |
Silicone spacers | Grainger | 1MWA4 |
Biopsy punches | Acuderm | P1025 (10 mm) P850 (8 mm) |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Hyclone | SH30028 |
Iodixanol (NycoPrep) | Fisher | NC9388846 |
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Life Technologies | 11054 |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 |
Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140 |
C2C12 myoblasts | ATCC | CRL-1772 |
MALDI | Bruker | N/A |
UVR-9000 | Bayco | UVR-9000 |
VersaDoc | Bio-Rad | N/A |