Hier beschrijven we een unieke strategie voor het maken van biocompatibele, gelaagde matrices met continue interfaces tussen verschillende lagen van tissue engineering. Een dergelijke steiger kan een ideale aanpasbare omgeving te moduleren cel gedrag van verschillende biologische, chemische of mechanische signalen
Weefselkweek complexe matrices, waarbij typen en concentraties van biologische stimuli (bijvoorbeeld groeifactoren, remmers of kleine moleculen) of matrix structuur (bijvoorbeeld samenstelling, concentratie of stijfheid van de matrix) variëren ruimte kan zorgen diverse onderzoeken over hoe deze variabelen cel differentiatie, migratie en andere fenomenen beïnvloeden. De grote uitdaging in het creëren van gelaagde matrices is het handhaven van de structurele integriteit van de laag-interfaces zonder diffusie van afzonderlijke onderdelen van elke laag 1. Huidige methoden om dit te bereiken zijn onder andere photopatterning 2-3, lithografie 4, sequentiële functionalization5, vriesdrogen 6, microfluidics 7 of centrifugeren 8, waarvan vele vereisen geavanceerde instrumentatie en technische vaardigheden. Anderen vertrouwen op sequentiële bevestiging van afzonderlijke lagen, hetgeen kan leiden tot delaminatie van lagen 9 </sup>.
DGMP overwint deze problemen door gebruik van een inert dichtheid modificator zoals iodixanol op lagen van verschillende dichtheden 10 maken. Aangezien de dichtheid modifier kan worden gemengd met een polymeer of bioactieve molecule, dGMP kan elke steiger lagen kunnen worden aangepast. Gewoon variëren van de concentratie van de dichtheid modifier voorkomt vermenging van aangrenzende lagen gedurende het verblijf waterige. Volgende stap polymerisatie leidt tot een structureel continue meerlaagse scaffold, waarbij elke laag verschillende chemische en mechanische eigenschappen. De dichtheid modifier kan gemakkelijk worden verwijderd met voldoende spoelen zonder verstoring van de afzonderlijke lagen of componenten. Deze techniek is daarom zeer geschikt voor het maken van hydrogels van verschillende afmetingen, vormen en materialen.
Een protocol voor het vervaardigen van een 2D-polyethyleenglycol (PEG) gel, waarbij afwisselende lagen bevatten RGDS-350, wordt hieronder beschreven. We gebruiken PEG banwege het is biocompatibel en inert. RGDS een celadhesie peptide 11 wordt gebruikt om ruimtelijke beperking van een biologische cue tonen en de conjugatie van een fluorofoor (Alexa Fluor 350) kunnen we visueel onderscheiden verschillende lagen. Deze procedure kan worden aangepast voor andere materialen (bijv. collageen, hyaluronzuur, etc.) en kan worden uitgebreid tot 3D gels fabriceren met enkele wijzigingen 10.
DGMP is een eenvoudige strategie voor het bereiden meerlaagse gels die niet vertrouwen op dure instrumentatie. Dit protocol kan worden aangepast voor het maken van steigers met andere biocompatibele materialen, zoals collageen en hyaluronzuur. Bioactieve kleine moleculen, bijvoorbeeld cel adhesie bevorderende peptide RGDS kan worden gebonden aan de polymere matrix om mengen van signalen tussen de lagen. Eiwitten kunnen worden opgenomen in afzonderlijke lagen zonder chemische conjugatie zij, afhankelijk van de matrix maaswijdte, zijn minder gevoelig voor diffunderen door hydrogels 10. Hier gebruikte iodixanol (Nycoprep), een inert dichtheid modifier, die eerder is gebruikt voor levensvatbare cellen toepassingen. Andere modifiers dichtheid zoals sucrose en dextrose kan ook worden gebruikt. Door het variëren van de afwikkeling van de tijd (t s), kan men afstemmen van de interfaces tussen twee lagen op gladde of scherpe overgangen te produceren als dat nodig is (langere inwerktijd zorgt voor een soepeler overgangen) <sup> 10. Zo zou vloeiender overgangen tussen dGMP gel lagen worden gebruikt om een continue gradiënt van een biologische cue naar cel processen zoals chemotaxis bestuderen genereren.
Het effect van de dichtheid op modifier gel stijfheid is getoond in figuur 5 voor een 15% aPEGda gel, een volledige karakterisering van stijfheid en porositeit als functie van PEGda en iodixanol concentraties wordt momenteel geëvalueerd. Terwijl de PEGda concentratie in dit voorbeeld relatief hoog zagen we een 60% grotere elasticiteitsmodulus in gels met 30% vergeleken met gels iodixanol zonder. De verandering in gel stijfheid kan worden aangepast door het moduleren van het macromeer concentratie of verknopingsdichtheid.
We hebben ook toegepast dGMP techniek 3D meerlagige gels met polyacrylamide en PEG 10 precursors creëren. Variëren van de concentratie of de mate van verknoping van het prepolymeer kan structurele variatie in descaffolds die gebruikt kan worden om cel gedrag zoals gepolariseerde groei en migratie in 3D onderzoeken.
Samengevat, dGMP is een flexibel techniek die kan worden toegepast op 2D en 3D scaffolds fabriceren van verschillende biocompatibele materialen voor een brede waaier van biomedische toepassingen en fundamenteel onderzoek.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs zijn dankbaar voor de steun van New Innovator NIH directeur Awards (1DP2 OD006499-01 naar AA en 1DP2 OD006460-01 tot AJE), en King Abdulaziz Stad voor Wetenschap en Technologie (UC San Diego Center of Excellence in Nanomedicine). We willen mevrouw Jessica Moore bedanken voor haar kritische commentaar op het manuscript.
Reagent or Instrument | Company | Catalogue number |
Polyethylene glycol succinimydyl carboxymethyl (a-PEG-SCM) | Laysan | 120-64 |
Polyethelyene glycol diacrylate (PEGda) | Dajac Labs | 9359 |
Arginine-Glycine-Aspartic acid-Serine (RGDS) | American Peptide | 49-01-4 |
N,N– Diisopropylethylamine (DIPEA) | Sigma | D125806 |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2438 |
N,N- dimethylformamide (DMF) | Fisher | D119-4 |
Tetrahydrofuran (THF) | Fisher | T397 |
Dialysis cassette (3500 Da) | Thermo Scientific | 66330 |
Alexa Fluor 350 carboxylic acid succinimydyl ester | Life Technologies | A-10168 |
Sigmacote | Sigma | SL2 |
Silicone spacers | Grainger | 1MWA4 |
Biopsy punches | Acuderm | P1025 (10 mm) P850 (8 mm) |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Hyclone | SH30028 |
Iodixanol (NycoPrep) | Fisher | NC9388846 |
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Life Technologies | 11054 |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 |
Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140 |
C2C12 myoblasts | ATCC | CRL-1772 |
MALDI | Bruker | N/A |
UVR-9000 | Bayco | UVR-9000 |
VersaDoc | Bio-Rad | N/A |