Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

שיפוע צפיפות רבה שכבתי פלמור (DGMP): שיטה חדשנית ליצירת תא בעל מספר, פיגומים להנדסת רקמות להתאמה אישית

doi: 10.3791/50018 Published: February 12, 2013

Summary

כאן אנו מתארים אסטרטגיה ייחודית ליצירת מטריצות ביולוגיות, שכבתיות עם ממשקים רציפים בין שכבות שונות להנדסת רקמות. כגון פיגום יכול לספק סביבה להתאמה אידיאלית לתא לווסת את התנהגות על ידי רמזים ביולוגיים, כימי או מכאניים שונים

Abstract

מטריצות שונות רקמות תרבות, שבו סוגים וריכוזים של גירויים ביולוגיים (למשל גורמי גדילה, מעכבים, או מולקולות קטנות) או מבנה מטריצה ​​(למשל הרכב, ריכוז, או נוקשות של המטריצה) משתנים במרחב, תאפשרנה מגוון רחב של חקירות באשר לשאלה כיצד משתנה אלה תשפיעו על התמיינות תאים, הגירה, ותופעות אחרות. האתגר העיקרי ביצירת מטריצות שכבתיות הוא שמירה על השלמות המבנית של ממשקי שכבה ללא דיפוזיה של רכיבים בודדים מכל שכבה 1. מתודולוגיות נוכחיות כדי להשיג זאת כוללות photopatterning 2-3, יתוגרפיה 4, functionalization5 הרציף, הקפאת ייבוש 6, 7 מיקרופלואידיקה, או צנטריפוגה 8, שרבים מהם דורשים מכשור מתוחכם ומיומנויות טכניות. אחרים מסתמכים על קובץ מצורף רציף של שכבות בודדות, דבר שעלול להוביל לdelamination של 9 שכבות

DGMP מתגבר על בעיות אלה באמצעות צירוף צפיפות אינרטי כמו iodixanol כדי ליצור שכבות של צפיפויות שונות 10. מאז ניתן לערבב צירוף הצפיפות עם כל prepolymer או מולקולה ביו, DGMP מאפשר לכל שכבת פיגום כדי להיות מותאמת אישית. כל שעליך לעשות שינוי הריכוז של צירוף הצפיפות מונע ערבוב של שכבות סמוכות בזמן שהם יישארו מימיים. פילמור צעד אחד לאחר מוליד רב שכבתי פיגום מבני מתמשך, שבו כל שכבה יש כימית ייחודיים ותכונות מכאניות. השינוי של הצפיפות ניתן להסיר בקלות עם מספיק שטיפה ללא הפרעה של השכבות הנפרדות או רכיביהם. טכניקה זו ולכן גם מתאימה ליצירת הידרוג בגדלים שונים, צורות וחומרים.

פרוטוקול לבודת ג'ל 2D-פוליאתילן גליקול (PEG), שבה לסירוגין שכבות לשלב Rgds-350, מפורט להלן. אנו משתמשים ב PEGecause הוא ביולוגי ואינרטי. Rgds, הידבקות תא 11 פפטיד, משמש כדי להדגים הגבלה המרחבי של אות ביולוגית, והנטייה של fluorophore (אלקסה פלואוריד 350) מאפשרת לנו להבחין חזותי שכבות שונות. הליך זה יכול להיות מותאם לחומרים אחרים (למשל קולגן, hyaluronan, וכו ') וניתן להאריך לפברק ג'לי 3D עם כמה שינויים 10.

Protocol

1. סינתזה של כותרתו fluorescently Acryloyl-PEG-Rgds

  1. מגיב פפטיד Rgds עם acryloyl-PEG-succinimidyl carboxymethyl אסתר (aPEG-SCM, PEG MW: 3400 g / mol) וNN diisopropylethylamine (DIPEA) ב1.2:1:2 יחסים טוחנים בsulfoxide דימתיל (DMSO) תחת ארגון בטמפרטורת חדר בן לילה.
  2. אשר הצמיד ידי מטריצת זמן בסיוע ליזר desorption / יינון של טיסה (MALDI-TOF) ספקטרומטריית מסות. הוסף μl 1 מתוך פתרון תגובת aPEG-Rgds לנקודת דגימה על יעד MALDI והיבש. הכן את פתרון רווי של יוניברסל MALDI מטריקס בtetrahydrofuran (THF) ומערבולת לדקות 1. הוסף ~ μl 1 של פתרון זה לאותה נקודת מדגם. חזור על התהליך עבור aPEG-SCM לשם השוואה. טען ולנתח. המשקל המולקולרי של aPEG-Rgds צריך להיות גדול מ-aPEG SCM (איור 2).
  3. להטות fluorophore, להוסיף סכום equimolar של חומצת Alexa פלואוריד 350 carboxylic (succinimydyl אסתר), מומסבנפח מינימאלי של DMSO, לפתרון תגובת aPEG-Rgds מ -1.1 ולהגיב תחת ארגון בטמפרטורת חדר למשך לילה.
  4. לטהר aPEG-Rgds-350 על ידי dialyzing (MW 3500 Da) נגד DI-H 2 O ב 4 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות ביחס הנפח 1,000:1, מחליף dialysate לפחות פעמים ביום.
  5. להקפיא לייבש המטוהרים aPEG-Rgds-350 בLabconco Freezone מערכת יבשה הקפאה שווה פלוס או ולאחסן ב -20 ° C.

2. הכנה של עובש וייצור של 2D ג'ל PEG 2D עם לסירוגין Rgds 350-שכבות

  1. הכן שקופיות זכוכית הידרופובי. הנח שקופיות זכוכית נקיות לתוך צלחת זכוכית בתנור ואקום. חום עד 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לייבוש מלא המשטחים. מקום צלחת עם שקופיות במנדף ולהוסיף Sigmacote μl 250 לכל שקופית, מנענע בעדינות למשך 30 שניות לכל משטח מעייל. יש לשטוף היטב את השקופיות המצופות עם מתנול 100%, ואחריו על ידי שטיפה במים מזוקקים, סופג פעמים למשך 5 דקות בשעת leas10 מ"ל לא.
  2. חותך מפרידי סיליקון (0.8 מ"מ עובי) עם 10 אגרופי מ"מ ביופסיה.
  3. חיטוי את מפרידי סיליקון ושקופיות זכוכית Sigmacote שטופלה.
  4. נסח את פתרונות לכל שכבה מתאימה בצינורות microfuge שונים על ידי PEG diacrylate ערבוב (PEGda) מבשר (ריכוז סופי 15% w / v) עם כמויות שונות של iodixanol (60% פתרון מנייה במים) לתשואה סופיים ריכוזים שונים (לדוגמא 40%, 30%, 20% ו 10%), להשלים את הנפח שנותר עם פוספט נאגרו מלוחים (PBS) להשיג פתרונות של צפיפויות מדורגות. באופן דומה, ללסירוגין שכבות, שילוב aPEG-Rgds-350 (8 מ"מ ריכוז סופי) עם iodixanol וPBS להניב ריכוזים שונים (35%, 25%, ו 15% לדוגמה).
  5. הוסף photoinitiator (2-הידרוקסי-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone, מניית 333mg/ml בN-יניל pyrrolidone) לכל אחד מפתרונות לשכבות שונות (10 μl של פתרון מניות למ"ל של כל אחד מפתרוני שכבה). אני Photoinitiatorזה הוסיף אחרון למנוע פילמור לפני השכבות של הג'לי בעובש, כפי שהוא רגיש לאור.
  6. הצעדים הבאים של פרוטוקול זה יתבצע בארון בטיחות ביולוגי על מנת להבטיח סטריליות.
  7. סנן-לעקר כל פתרון באמצעות מזרק סטרילי 1 מ"ל ו0.2 מיקרומטר מסנן. הרכב את ההתקנה על ידי עובש רבדת הרווח בין שתי שקופיות Sigmacore טופלה זכוכית ומאובטחת עם מהדק הצבה כמתואר באיור 1.
  8. להק את הג'לי השכבתי על ידי הוספת הפתרון הצפוף ביותר (למשל PEGda עם iodixanol 40%) הראשון, ואחרי פתרון פחות צפוף (למשל aPEG-Rgds-350 עם iodixanol 35%). חזור על השכבות החלופיות כדי להשיג כמה שכבות של הרכב וצפיפות רצויים כפי שמוצג באיור 1.
  9. להקרין את התבנית עם אור ננומטר 365 ל3 דקות באמצעות-9000 UVR מנורה ניידת. אפשר ג'לי polymerized לרפא למשך 5 דקות. הסר את המהדק, ואז בעדינות את הכוס העליונה שקופית והעובש; בג'לי DGMP מרובדות יישארו בשקופיות. בעזרת מרית סטרילי, למקם את הג'לי בזהירות בצינור המכיל 50 מ"ל סטרילי PBS או תרבות בינונית לכביסה.
  10. שטוף את הג'לים polymerized בPBS ביחס הנפח 1,000:1, מחליף חיץ לפחות פעמים ביום כדי להסיר את התכונה, הצפיפות, photoinitiator, ופולימר unreacted. לחלופין, PBS ניתן להחליף עם מדיום גידול תאים. אחסן את ג'לי DGMP באס או באמצעי גידול לניסוי תרבית התאים שמתוארים בשלב 3.
  11. כדי להמחיש לסירוגין שכבות, לארגן ג'ל DGMP (הג'לי האלה לא יהיה שמיש לתרבית תאים) יחד שליט על מגש המדגם של יחידת תיעוד ג'ל VersaDoc. לחשוף את הג'לי ב350 ננומטר; זמן החשיפה משתנה בהתאם לריכוז של fluorophore. לסירוגין פסים כהים וכחולים בידרוג DGMP להדגים היווצרות שכבות נפרדות של הרכב כימי ייחודי (איור 3).

"Jove_title"> 3. תא תרבות 2D בג'לי DGMP

  1. לג'לי שילוב פפטיד Rgds, להשתמש בתאים תלויים הידבקות, כגון C2C12 myoblasts.
  2. הכנס בעדינות ג'לי DGMP (מאוחסן בPBS) לתוך הבארות של צלחות תרביות תאים 48-כן באמצעות מגרד תא סטרילי בארון בטיחות ביולוגי.
  3. בינוני מראש חם צמיחה (בינוני או DMEM של Dulbecco העדכון של הנשר בתוספת 10% 1% פתרון 100x v / v פניצילין סטרפטומיצין סרום שור עוברי v / v ו) ו-PBS באמבט מים נקבע על 37 ° C.
  4. שטוף 60% צלחת confluent (10 מ"מ) של C2C12 תאים שלוש פעמים עם PBS. לשאוב את PBS ותאי קציר על ידי הוספת 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA ודוגר על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. Resuspend התאים במדיום גידול ותאי ספירה. הזרעים DGMP ג'ל המכיל תרבית תאים היטב עם C2C12 myoblasts (20,000 תאים / סנטימטר 2). דגירת התאים ב 37 ° C ב5% CO 2 / לחות יחסית של 95%. עדינות בינונית חילופים אחרי 4 שעות, נזהר שלא מחדשלהעביר תאים דבקו בקלילות.
  5. לאחר 24 שעות, את הקובץ המצורף של C2C12 myoblasts בשכבות Rgds המכילים ג'ל של DGMP עשוי להיות מאושר על ידי epifluorescence ומיקרוסקופי לעומת שלב (Zeiss Axiovert 200).

Representative Results

ניתוח MALDI-TOF מאשר את הנטייה של פפטיד Rgds לacryloyl-PEG (איור 2). ג'ל הדמיה מגלה לסירוגין Rgds-350 שכבות (כחול) לאחר photopolymerization (איור 3 א). כפי שניתן לראות באיור 3 א, גודל ג'ל DGMP 2D יכול להיות מגוון המבוסס על הקוטר של תבניות סיליקון (10 מ"מ, שמאל; 8 מ"מ, מימין), ולכן הם בקלות להתאמה לשימוש במבחנים מרובים - במקרה זה כדי שיתאים צלחת 48 גם תרבות תאים (איור 3 ב '). Epifluorescence ומיקרוסקופ לעומת השלב של C2C12 myoblasts תרבית בג'ל DGMP תערוכות מצורפות סלקטיבי על Rgds-350 המכיל שכבות PEG (איור 4), הוכחת מידור של פפטיד הידבקות התא (Rgds).

איור 1
איור 1. המולקולרי weigניתוח HT ידי MALDI-TOF השוואת aPEG-SCM ל- Rgds aPEG הושג לאחר נטייה של פפטיד Rgds.

איור 2
איור 2. ייצוג סכמטי של ייצור ג'ל DGMP. לאחר הדרגתי בשכבות, הם יכולים להיות מותרים להסתפק בפרקי הזמן שונה (t ים) על מנת ליצור ממשקים מדורגים, ואחרי photopolymerization. ג'לי DGMP מרובדת ניתן לחלץ בקלות מהתבנית לשימוש נוסף. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 3
איור 3). A ג'לי multilayered 2D המתקבל לאחר photopolymerization צלם באמצעות 350 ננומטר וערוצי אור לבן של Versaיחידת תיעוד ג'ל דוק. תמונה בגוונים אפורים מגלה לסירוגין שכבות המכילות Rgds בלבן. B) החדרת ג'ל DGMP לתוך מנות תרבות תאים 48-כן.

איור 4
איור 4. לעומת שלב ממוזג ותמונה של epifluorescence C2C12 myoblasts גדל על DGMP ג'לי (50 מיקרומטר סרגל קנה מידה).

איור 5
איור 5. השפעת iodixanol על גמישות משטח ג'ל. מדידות כוח אטומיות מיקרוסקופיות של דגימות סטטיות של מצעי PEG crosslinked בשיטות שנקבעו בעבר עם הדק 2 NN כוח 12. * P <0.05 ו ** P <0.01.

Discussion

DGMP היא אסטרטגיה פשוטה להכנת ג'לי multilayered שאינו מסתמך על מכשור יקר. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם ליצירת פיגומים באמצעות חומרים ביולוגיים אחרים, כגון קולגן וחומצה היאלורונית. מולקולות קטנות יו, למשל תא הידבקות-קידום פפטיד Rgds, ניתן קשורים לפולימר מטריקס כדי למנוע ערבוב של רמזים בין שכבות. חלבונים יכולים להיות גלומים בשכבות נפרדות ללא צורך בצימוד כימי כפי שהם, תלוי בגודל רשת מטריקס, הם פחות נוטים לנטרל באמצעות הידרוג 10. כאן נקטתי iodixanol (Nycoprep), צירוף צפיפות אינרטי, אשר בעבר שמש במשך יישומי תא קיימא. מכפילי צפיפות אחרות כמו סוכרוז ודקסטרוז יכולים לשמש גם. על ידי שינוי זמן השיקוע (לא ים), ניתן לכוונן את הממשקים בין שתי שכבות לייצר מעברי חלקים או חריפים לפי צורך (זמן ארוך יותר ליישב נותן מעברים חלקים) <sup> 10. לדוגמה, מעברים חלקים יותר בין שכבות ג'ל DGMP יכולים לשמש כדי ליצור שיפוע מתמשך של אות ביולוגית כדי ללמוד על תהליכים בתא, כגון chemotaxis.

ההשפעה של צירוף צפיפות בנוקשות ג'ל מוצגת בתרשים 5 ל15% aPEGda ג'ל; אפיון מלא יותר של נוקשות ונקבוביות כפונקציה של PEGda וריכוזי iodixanol כעת נבדקת. בעוד ריכוז PEGda בדוגמה זו הוא גבוה יחסית, נצפינו מודולוס אלסטיות 60% יותר בג'לי עם iodixanol 30% בהשוואה לג'לי בלי. השינוי בנוקשות ג'ל יכול להיות מותאם על ידי ויסות ריכוז macromer או צפיפות crosslinking.

יש לנו גם ליישם את טכניקת DGMP ליצור ג'לי multilayered 3D באמצעות polyacrylamide ומבשרי PEG 10. משנה את הריכוז או את מידת crosslinking של prepolymer מאפשר וריאציה מבנית בפיגומים, שניתן להשתמש בם כדי לחקור את התנהגות תא כגון צמיחה והגירה מקוטבות ב-3D.

לסיכום, DGMP היא טכניקה להתאמה שניתן ליישם כדי לפברק פיגומי 2D and 3D ממגוון רחב של חומרים ביולוגיים עבור מגוון רחב של יישומי מחקר ביו ובסיסיים.

Disclosures

המחברים אין אינטרסים מנוגדים לגילוי.

Acknowledgments

המחברים מודים לתמיכה מפרסי Innovator החדשים של NIH (מנהל 1DP2 OD006499-01 ל AA ו1DP2 OD006460-01 לAJE), ומלך Abdulaziz עיר למדע והטכנולוגיה (אוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו מרכז מצוין בNanomedicine). ברצוננו להודות לגב 'ג'סיקה מור להערות הביקורתיות שלה על כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyethylene glycol succinimydyl carboxymethyl (a-PEG-SCM) Laysan 120-64
Polyethelyene glycol diacrylate (PEGda) Dajac Labs 9359
Arginine-Glycine-Aspartic acid-Serine (RGDS) American Peptide 49-01-4
N,N- Diisopropylethylamine (DIPEA) Sigma D125806
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2438
N,N- dimethylformamide (DMF) Fisher D119-4
Tetrahydrofuran (THF) Fisher T397
Dialysis cassette (3500 Da) Thermo Scientific 66330
Alexa Fluor 350 carboxylic acid succinimydyl ester Life Technologies A-10168
Sigmacote Sigma SL2
Silicone spacers Grainger 1MWA4
Biopsy punches Acuderm P1025 (10 mm)
P850 (8 mm)
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Hyclone SH30028
Iodixanol (NycoPrep) Fisher NC9388846
2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone Sigma 410896
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) Life Technologies 11054
Fetal bovine serum Life Technologies 10082
Penicillin-streptomycin Life Technologies 15140
C2C12 myoblasts ATCC CRL-1772
MALDI Bruker N/A
UVR-9000 Bayco UVR-9000
VersaDoc Bio-Rad N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Place, E. S., Evans, N. D., Stevens, M. M. Complexity in biomaterials for tissue engineering. Nat. Mater. 8, 457-470 (2009).
  2. Liu, V. A., Jastromb, W. E., Bhatia, S. N. Engineering protein and cell adhesivity using PEO-terminated triblock polymers. J. Biomed. Mater. Res. 60, 126-134 (2002).
  3. Sharma, B., et al. Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage. Tissue Eng. 13, 405-414 (2007).
  4. Hahn, M. S., et al. Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels. Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).
  5. Kizilel, S., Sawardecker, E., Teymour, F., Perez-Luna, V. H. Sequential formation of covalently bonded hydrogel multilayers through surface initiated photopolymerization. Biomaterials. 27, 1209-1215 (2006).
  6. Harley, B. A., et al. Design of a multiphase osteochondral scaffold. II. Fabrication of a mineralized collagen-glycosaminoglycan scaffold. J. Biomed. Mater. Res. A. 92, 1066-1077 (2010).
  7. Cuchiara, M. P., Allen, A. C., Chen, T. M., Miller, J. S., West, J. L. Multilayer microfluidic PEGDA hydrogels. Biomaterials. 31, 5491-5497 (2010).
  8. Roam, J. L., Xu, H., Nguyen, P. K., Elbert, D. L. The formation of protein concentration gradients mediated by density differences of poly(ethylene glycol) microspheres. Biomaterials. 31, 8642-8650 (2010).
  9. Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures. J. Biomed. Mater. Res. A. 85, 611-618 (2008).
  10. Karpiak, J. V., Ner, Y., Almutairi, A. Density gradient multilayer polymerization for creating complex tissue. Adv. Mater. 24, 1466-1470 (2012).
  11. Pierschbacher, M. D., Ruoslahti, E. Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule. Nature. 309, 30-33 (1984).
  12. Kaushik, G., Fuhrmann, A., Cammarato, A., Engler, A. J. In Situ Mechanical Analysis of Myofibrillar Perturbation and Aging on Soft, Bilayered Drosophila Myocardium. Biophysical Journal. 101, 2629-2637 (2011).
שיפוע צפיפות רבה שכבתי פלמור (DGMP): שיטה חדשנית ליצירת תא בעל מספר, פיגומים להנדסת רקמות להתאמה אישית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Joshi-Barr, S., Karpiak, J. V., Ner, Y., Wen, J. H., Engler, A. J., Almutairi, A. Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (72), e50018, doi:10.3791/50018 (2013).More

Joshi-Barr, S., Karpiak, J. V., Ner, Y., Wen, J. H., Engler, A. J., Almutairi, A. Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (72), e50018, doi:10.3791/50018 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter