Aquí se describe una estrategia única para la creación de matrices biocompatibles, capas continuas con interfaces entre capas distintas para la ingeniería de tejidos. Tal andamio podría proporcionar un entorno adaptable ideal para modular el comportamiento celular por varias señales biológico, químico o mecánico
Complejas matrices de cultivo de tejidos, en el que los tipos y concentraciones de los estímulos biológicos (por ejemplo, factores de crecimiento, inhibidores, o pequeñas moléculas) o la estructura de la matriz (por ejemplo, composición, concentración, o la rigidez de la matriz) varían en el espacio, que permiten una amplia gama de investigaciones sobre cómo estas variables afectan la diferenciación celular, la migración y otros fenómenos. El principal reto en la creación de matrices de capas es el mantenimiento de la integridad estructural de las interfaces de capa sin difusión de los componentes individuales de cada capa 1. Las metodologías actuales para ello es photopatterning 2-3, litografía 4, functionalization5 secuencial, liofilización 6 de microfluidos 7, 8 o centrifugación, muchos de los cuales requieren instrumentos sofisticados y habilidades técnicas. Otros confían en unión secuencial de las capas individuales, que pueden llevar a la deslaminación de las capas 9 </sup>.
DGMP supera estos problemas mediante el uso de un modificador de la densidad inerte tal como iodixanol para crear capas de densidades variables 10. Dado que el modificador de la densidad se puede mezclar con cualquier prepolímero o molécula bioactiva, DGMP permite que cada capa andamio para personalizar. Simplemente variando la concentración del modificador de la densidad evita que se mezclen las capas adyacentes mientras permanecen acuosa. Polimerización subsiguiente solo paso da lugar a una estructura de andamio continuo de múltiples capas, en la que cada capa tiene química distinta y propiedades mecánicas. El modificador de la densidad se puede quitar fácilmente con suficiente lavado sin perturbación de las capas individuales o sus componentes. Esta técnica es por lo tanto muy adecuado para la creación de hidrogeles de diversos tamaños, formas y materiales.
Un protocolo para la fabricación de un 2D-polietilenglicol (PEG) gel, en el que las capas alternantes incorporar RGDS-350, se describe a continuación. Utilizamos PEG bomo es biocompatible e inerte. RGDS, una adhesión celular péptido 11, se utiliza para demostrar restricción espacial de una señal biológica, y la conjugación de un fluoróforo (Alexa Fluor 350) nos permite distinguir visualmente distintas capas. Este procedimiento se puede adaptar para otros materiales (por ejemplo, colágeno, ácido hialurónico, etc) y se puede ampliar para fabricar geles 3D con algunas modificaciones 10.
DGMP es una estrategia sencilla para la preparación de geles de capas múltiples que no se basan en instrumentos costosos. Este protocolo se puede adaptar para crear andamios utilizando otros materiales biocompatibles, tales como colágeno y ácido hialurónico. Pequeñas moléculas bioactivas, por ejemplo de células que promueve la adhesión péptido RGDS, puede estar amarrado a la matriz de polímero para evitar la mezcla de las señales entre las capas. Las proteínas se pueden encapsular en capas distintas, sin necesidad de conjugación química, ya que, dependiendo del tamaño de la malla de la matriz, son menos propensos a difundirse a través de hidrogeles 10. Aquí hemos utilizado iodixanol (Nycoprep), un modificador de la densidad inerte, que se ha utilizado anteriormente para las aplicaciones de células viables. Otros modificadores de la densidad tales como sacarosa y dextrosa también se puede utilizar. Al variar el tiempo de establecimiento (t s), se puede ajustar con precisión las interfaces entre las dos capas para producir una transición suave o fuerte, según sea necesario (tiempo de asentamiento más aporta mayor suavidad a las transiciones) <sup> 10. Por ejemplo, transiciones más suaves entre las capas de gel dGMP podría ser utilizado para generar un gradiente continuo de una señal biológica para estudiar procesos celulares, tales como la quimiotaxis.
El efecto modificador de la densidad sobre la rigidez de gel se muestra en la Figura 5 para un 15% de gel de aPEGda; una caracterización más completa de la rigidez y de la porosidad como una función de las concentraciones de iodixanol PEGDA y se está evaluando actualmente. Mientras que la concentración de PEGDA en este ejemplo es relativamente alta, se observó un módulo de 60% mayor elástica en geles con 30% iodixanol comparación con los geles sin. El cambio en la rigidez del gel se puede ajustar mediante la modulación de la concentración de macrómero o la densidad de reticulación.
También hemos aplicado la técnica DGMP para crear 3D geles de poliacrilamida utilizando múltiples capas y los precursores de PEG 10. La variación de la concentración o el grado de reticulación del prepolímero permite variación estructural en elandamios, que pueden ser utilizados para explorar el comportamiento celular tales como el crecimiento y la migración polarizada en 3D.
En resumen, DGMP es una técnica adaptable que se puede aplicar para fabricar andamios 2D y 3D a partir de una variedad de materiales biocompatibles para una amplia gama de aplicaciones de investigación biomédica y de base.
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen el apoyo de los Premios Innovadores Nuevos NIH Director (1DP2 OD006499-01 a AA y 1DP2 OD006460-01 a AJE) y la Ciudad Rey Abdulaziz para la Ciencia y la Tecnología (Universidad de California en San Diego Centro de Excelencia en Nanomedicina). Nos gustaría dar las gracias a la Sra. Jessica Moore por sus comentarios críticos sobre el manuscrito.
Reagent or Instrument | Company | Catalogue number |
Polyethylene glycol succinimydyl carboxymethyl (a-PEG-SCM) | Laysan | 120-64 |
Polyethelyene glycol diacrylate (PEGda) | Dajac Labs | 9359 |
Arginine-Glycine-Aspartic acid-Serine (RGDS) | American Peptide | 49-01-4 |
N,N– Diisopropylethylamine (DIPEA) | Sigma | D125806 |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2438 |
N,N- dimethylformamide (DMF) | Fisher | D119-4 |
Tetrahydrofuran (THF) | Fisher | T397 |
Dialysis cassette (3500 Da) | Thermo Scientific | 66330 |
Alexa Fluor 350 carboxylic acid succinimydyl ester | Life Technologies | A-10168 |
Sigmacote | Sigma | SL2 |
Silicone spacers | Grainger | 1MWA4 |
Biopsy punches | Acuderm | P1025 (10 mm) P850 (8 mm) |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Hyclone | SH30028 |
Iodixanol (NycoPrep) | Fisher | NC9388846 |
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Life Technologies | 11054 |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 |
Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140 |
C2C12 myoblasts | ATCC | CRL-1772 |
MALDI | Bruker | N/A |
UVR-9000 | Bayco | UVR-9000 |
VersaDoc | Bio-Rad | N/A |