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Neuroscience

Vertical Test Choix labyrinthe en T pour la réponse aux arthropodes odorants

doi: 10.3791/50229 Published: February 14, 2013

Summary

Une verticale, labyrinthe en T olfactomètre est décrite pour le dosage de la réponse comportementale des arthropodes. L'olfactomètre permet à l'expérimentateur de mesurer les choix effectués par les sujets testés lorsqu'ils sont soumis à deux champs d'odeurs potentielles. Tant d'attraction et de répulsion à partir de substances odorantes peuvent être mesurés avec cet appareil.

Abstract

Compte tenu de l'importance économique des insectes et des arachnides comme les ravageurs des cultures agricoles, les milieux urbains ou en tant que vecteurs de maladies des plantes et de l'homme, diverses technologies sont développées comme des outils de contrôle. Un sous-ensemble de ces outils met l'accent sur la modification du comportement des arthropodes par attraction ou de répulsion. Par conséquent, les arthropodes sont souvent l'objet d'enquêtes comportementales. Différents outils ont été développés pour mesurer le comportement des arthropodes, y compris les tunnels à vent, moulins, vol servospheres, et divers types de olfactomètres. L'objectif de ces outils est de mesurer la réponse des insectes ou arachnide à des signaux visuels ou olfactifs plus souvent. Le labyrinthe en T vertical oflactometer décrit ici mesure des choix effectués par les insectes en réponse à des attractifs ou répulsifs. Il s'agit d'un dispositif d'analyse à haut débit qui tire parti de la phototaxie positive (attraction à la lumière) et négatifs (géotaxie tendance à marcher ou voler vers le haut) exposées par des arthropodes nombreux. Le olfactometer compose d'un tube en verre de 30 cm qui est divisé en deux avec une bande de Téflon formant un labyrinthe en T. Chaque moitié sert un bras de l'olfactomètre permettant aux sujets d'expérience à faire un choix entre deux champs d'odeurs potentielles dans des essais impliquant des substances attractives. Dans les essais impliquant des répulsifs, l'absence de réponse normale à des attractifs connus peuvent également être mesurée par une troisième variable.

Introduction

Arthropodes (y compris les insectes et les arachnides) sont souvent définis comme des parasites, soit parce qu'ils en concurrence avec la consommation humaine en milieu agricole ou urbain ou transmettre des agents pathogènes responsables de la maladie 1. Une grande quantité d'investissement est réalisé dans le développement d'outils de contrôle de ces parasites. Ces outils peuvent varier considérablement et des progrès significatifs ont été accomplis dans le développement d'outils bio-rationnels que ce soit de modifier ou d'exploiter le comportement naturel des ravageurs avec l'utilisation d'attractifs ou répulsifs comportementaux 2,3.

Arthropodes nuisibles reposent souvent sur ​​des signaux olfactifs ou repères pour s'accoupler et / ou de l'hôte emplacement 4. Par conséquent découverte des attractifs ou répulsifs efficaces contre les organismes nuisibles peut souvent mener au développement d'outils de contrôle. Ce processus de découverte comprend plusieurs étapes. Tout d'abord, le comportement naturel du sujet de test doit être comprise. Par exemple, il faut vérifier si un sexe d'une espèce donnée attire l'inversele sexe pour emplacement de la contrainte. Si c'est le cas, il faut déterminer si cette attraction est médiée par un produit chimique, et où cette substance est produite. D'autres mesures consistent à déterminer si le produit chimique est produit et son éventuelle identification. Tout au long de cette procédure, (insectes ou acariens) fait l'objet de test de réponse comportementale aux substances odorantes doivent être testés. Initialement, le comportement du sujet de test sera testé pour la matière naturelle. Par exemple, la réponse d'un papillon mâle peut être testé à celle de l'extrait de son congénère femelle glande phéromone. Sinon, la réponse d'un herbivore aux odeurs naturelles de la plante hôte peut être testé. Bien que ces enquêtes ont souvent une orientation pratique sur le développement des outils de gestion de 5,6, ils peuvent également être appliqués à la recherche qui porte sur des questions plus fondamentales telles que la spéciation 7. Les étapes suivantes impliquent de tester la réponse de l'arthropode à des versions synthétiques de produits naturels identifiés.

Uomprendre comment répondre aux arthropodes produits chimiques nécessite le développement d'outils appropriés pour mesurer leur comportement. Les données générées par ces outils dépendra de la façon dont l'enquêteur est capable de mesurer des comportements naturels dans un environnement contrôlé. Plus il ya six décennies, olfactomètres vol et de tunnels soutenus ont été développés pour mesurer la réponse des insectes à 8,9 odorants. Olfactomètres varier de manière significative dans la conception et sont souvent adaptés à l'insecte ou un problème spécifique à l'étude. Le but de cet article est de décrire la conception et l'utilisation d'une orientation verticale, labyrinthe en T olfactomètre pour mesurer la réponse des insectes aux substances odorantes (figure 1). L'orientation verticale olfactomètre tire profit de la géotaxie négatif (tendance à se déplacer vers le haut) exposées par de nombreux insectes. Une source lumineuse placée directement au-dessus de l'olfactomètre tire parti de la phototaxie positif (tendance à se déplacer vers la source de lumière) présenté par de nombreux insectes. Le olfactommètre est particulièrement utile pour les insectes hémiptères qui ont tendance à ne pas exposer le mouvement facilement dans olfactomètres orientés horizontalement et qui sont fortement influencés par l'intensité de la lumière par rapport à l'orientation. Cependant, ce dispositif peut être utilisé pour un large éventail d'insectes volants et rampants, ainsi que des arachnides. L'olfactomètre peut être utilisé pour évaluer à la fois attractifs et répulsifs. Dans le cas des appâts, le champ d'odeur bifurqué (Figure 1) est établi avec l'attractif présumé libéré d'un côté par rapport à l'air pur sorti sur le côté opposé. Un choix est enregistré lorsque l'insecte sorti à la base de l'olfactomètre choisit l'un des deux champs d'odeurs. Dans le cas des répulsifs, un troisième comportement est possible. En plus des mouvements vers le haut dans l'un des deux champs d'odeur, l'absence de mouvement vers le haut peut être enregistré indiquant un stimulus non-réactif ou pour repousser les champs de stimulus soit odeurs.

Protocol

  1. Assemblée d'une coutume conçue, deux ports divisée T-olfactomètre décrit précédemment dans Mann et al. 10 est représentée sur la figure 1. L'olfactomètre est constitué d'un tube en verre 30 cm qui est bifurquée dans deux orifices distincts avec une bande de téflon formant un labyrinthe en T. Chaque moitié est analogue à un bras d'un olfactomètre de style 2-choix permettant au sujet d'essai pour choisir entre deux champs d'odeurs potentielles.
    1. Tests d'assemblage et ultérieur doit avoir lieu dans une salle à température contrôlée ou de la chambre de l'environnement.
    2. Mont de verre labyrinthe en T olfactomètre verticalement, comme représenté dans la figure 1 et le positionner sous une lampe fluorescente ampoule 900 lux.
    3. Pour une diffusion optimale de la lumière, l'ensemble doit être monté dans un 1,0 x 0,6 x 0,6 m contenant opaque afin de maximiser la diffusion uniforme de la lumière.
    4. Connectez les bras olfactomètre à des sources d'odeurs qui seront logés en phase solide micro-extraction à la source exploitation / odeur chamber (SPMEC) (ARS, Inc, Gainesville, FL) via téflon; raccords de tube en verre. Chaque SPMEC est constitué d'un tube de verre droit (17,5 cm de longueur x 3,5 cm de largeur) supporté avec une entrée et sortie de soupape pour les flux d'air entrant et sortant (figure 1).
    5. Connecter le système d'alimentation en air à une source externe d'air humidifié et purifié de carbone qui est sous pression constante (le système de distribution d'air présente à la fois un filtre à charbon pour la purification de l'air intérieur et un barboteur d'air pour l'humidification, si les sources externes ne sont pas disponibles).
    6. Dissoudre échantillons chimiques désirées dans un diluant approprié (solvant) et la pipette sur un substrat à libération lente comme une mèche de coton (Petty John Packaging, Inc, Concord, Caroline du Nord). Le traitement de contrôle devrait consister en une mèche de coton imprégnés de solvant seulement.
    7. Pour éviter une contamination importante de la verrerie, envelopper les mèches de coton traités et témoins dans les tissus de laboratoire (Kimwipes, Kimberly-Clark, Roswell, Géorgie) et mettre dans les bras SPMEC deux (ARS, Inc, Gainesville, FL). Dans le cas des échantillons de plantes vivantes, une chambre de collecte guillotine volatile peut être attaché à l'olfactomètre contenant les traitements à la place du SPMEC (Figure 1).
    8. Fournir de l'air humidifié et purifié à travers le SPMEC (ou chambre guillotine volatile) via deux pompes raccordées à un système de distribution d'air (figure 1). Maintenir un débit d'air de 0,1 L / min à travers les deux bras de l'olfactomètre.
  2. Employant olfactomètre pour tester la réaction des arthropodes aux répulsifs putatifs. Dans la présente description, un insecte hémiptères, psylle asiatique des agrumes, Diaphorina citri, a été utilisé comme un arthropode test. Réponse a été testée par les volatiles agrumes, seul ou en combinaison avec un (disulfure de diméthyle) et repoussant l'air pur en tant que sources d'odeurs.
    1. Effectuer toutes les expériences à une température et une humidité relative normalisée.
    2. Avant tous les tests, exposer test Couleur sujets pour nettoyer l'air de l'air par rapport à l'air propre ou solvant par rapport propre à l'olfactomètre labyrinthe en T pour vérifier l'absence de biais positionnel ou un effet de solvant sur le comportement du sujet de test.
    3. Assigner une source de l'odeur de façon aléatoire l'une des branches de l'olfactomètre au début de chaque essai biologique. Inverser cette position toutes les 10 sujets testés doser, au minimum, afin d'éliminer la possibilité de biais de position.
    4. Tester la réponse d'un minimum de 30 (et jusqu'à 120) des sujets de test par combinaison de traitement.
    5. Permettez-test de sujets 100-300 sec à présenter une réponse comportementale basée sur la réponse précédemment établi (latence) d'intervalle.
    6. Indiquez si un objet pénètre dans le bras traitement, bras de commande ou reste dans le port de libération ou au-dessous du pôle T-labyrinthe.
    7. Note choix bras de traitement ou de contrôle quand un sujet de test traverse la division dans le labyrinthe en T et se déplace dans chaque bras olfactomètre.
    8. Note choix bras de libération lorsqu'un test sous reste dans l'orifice d'échappement ou au-dessous du pôle T-labyrinthe.
    9. Nettoyez l'olfactomètre et tubes de liaison à fond avec une solution savonneuse 2% et faire cuire les éléments en verre à 200 ° F entre l'utilisation de traitements d'odeurs différentes.
    10. Pour les essais dans lesquels putatifs traitements répulsifs sont présentés dans l'olfactomètre labyrinthe en T avec ou sans traitement chimique par rapport à l'air pur, de comparer le nombre de sujets de test restantes au point de restitution et ne pénètrent pas dans l'olfactomètre entre les traitements par une analyse de variance ( ANOVA) suivie d'un test HSD de Tukey (α <0,05). Dans les cas où les sujets d'expérience quittent le bras de libération, comparez le numéro de choisir le groupe témoin, contre le bras de traitement avec chi carré (χ 2) l'analyse à α <0,05.

Representative Results

Activité du psylle asiatique des agrumes (Diaphorina citri) adultes aux odeurs de leurs natal volatiles de la plante hôte (agrumes) est représenté sur la figure 2A. Adultes de façon significative (α <0,05) plus choisi le bras de l'olfactomètre labyrinthe en T recevoir les odeurs de plantes d'agrumes de vie par rapport à un blanc (pureté de l'air) de commande.

Un exemple de répulsion est montré dans la figure 2B. Dans ce cas, les insectes ont été exposés à un bras de substances volatiles T-recevant labyrinthe d'agrumes, tandis que le second bras reçu volatiles d'une plante d'agrumes qui a été traitée avec le plus connu répulsif, le disulfure de diméthyle 11. Dans ce cas, trois types de comportements ont été observés. Le nombre de psylles arrêtés au bras de libération et de ne pas répondre ne diffèrent pas statistiquement à partir du numéro entrant dans le bras recevant les odeurs de plantes d'agrumes seuls (figure 2B). Toutefois, aucune psylles entré dans le bras contenant til plante hôte volatile en cas de co-présenté avec le répulsif (figure 2B).

Figure 1
Figure 1. Schéma de principe d'orientation verticale labyrinthe en T olfactomètre joint au système de distribution d'air et appareils de traitement des odeurs de libération. Le diagramme est une adaptation de la figure 1 dans Mann et coll. 10. Un objet de test est placé individuellement dans la chambre de libération de l'orifice 2-T-olfactomètre divisé. Il se déplace vers les odeurs grâce à une vanne qui permet un mouvement contrôlé vers le haut dans l'olfactomètre et empêche l'insecte rampant dans la zone du point de libération. Le tube de 10 cm bifurque après la valeur à la ferme. Une réponse positive à une odeur est enregistré une fois l'insecte se déplace de 0,5 cm dans un côté spécifique de la division. La chambre de collecte guillotine volatile peut être utilisée à la place d'un solide pvvihe micro-extraction de maintien / chambre de source d'odeur (SPMEC) en tant que source de l'odeur.

Figure 2
Figure 2. Réponse du psylle asiatique des agrumes (Diaphorina citri) adultes aux substances volatiles de plantes hôtes d'agrumes contre contrôle qualité de l'air (A) ou volatiles agrumes contre volatiles agrumes co-publiés avec un (diméthyl disulfure) et hydrofuge (B) dans une orientation verticale T labyrinthe en olfactomètre Figure 2A:. One-analyse de variance (ANOVA) suivie d'un test HSD de Tukey (α <0,05) a été réalisée pour comparer le nombre de psylle de faire un choix entre les deux bras (2 traitements, n = 120). Colonnes indiquées par des lettres différentes sont significativement différentes les unes des autres (α <0,05) Figure 2B:. Sens unique analysest la variance (ANOVA) suivie d'un test HSD de Tukey (α <0,05) a été réalisée pour comparer le nombre de psylle de faire un choix entre les deux bras ou restant dans le point de rejet (3 traitements, n = 120). Colonnes indiquées par des lettres différentes sont significativement différentes les unes des autres (α <0,05).

Discussion

Ici, un dispositif de dosage et le protocole décrit pour la mesure de la réponse de petits arthropodes (insectes: Hemiptera: Psyllidae) vers odorants. Le procédé comprend le choix d'un test, permettant à l'insecte de faire un choix entre deux champs odorants dans le cas des essais évaluant un attractif putatif. En outre, le sujet peut afficher trois types de comportements en laissant le bras de libération et en entrant un ou l'autre des deux champs d'odeurs potentielles, ou de rester dans le bras de libération, dans le cas des essais de répulsion. L'olfactomètre permet un débit de données de collecte élevé, car il tire parti de la geotactic négatif (tendance à se déplacer vers le haut) et phototactiques positif (tendance à se déplacer vers la lumière) naturelle réponse comportementale de nombreux arthropodes. Bien que la présente démonstration utilise un exemple des insectes psylle essai, le dosage peut être facilement adapté pour les arthropodes largement, à la fois ceux qui utilisent vol ou la marche comme principaux modes de transport.

12. Les conceptions spécifiques de ces olfactomètres varient considérablement; cependant, des variations sur le thème général de l'épreuve à deux choix décrits ici, ainsi que, semblables Y-tube tests ont été souvent utilisé pour mesurer la réponse des arthropodes aux produits chimiques. Tunnels de vol plus susceptibles de causer un vol soutenu d'insectes 9 ont également donné lieu à la collecte des données inédites élucider les mécanismes fondamentaux du vol des insectes et d'orientation pour les écomones, ainsi que l'information des données, l'utilisation pratique des outils de lutte antiparasitaire.

Il est souvent nécessaire de concevoir sur mesure un olfactomètre et l'instrumentation associée pour la biologie des arthropodes du sujet de test spécifique. Ces olfactomètres qui peuvent être utilisés au sein d'un groupe général d'insectes sont plus utiles que les specific à un petit groupe, mais parfois l'importance économique d'un petit groupe d'insectes dicte la nécessité du développement d'un olfactomètre très spécifique et technique de dosage. La conception actuellement décrites s'appuie sur des techniques d'arthropodes déjà familiers. Elle permet une plus standard à deux choix test de Y-tube bioessais dans lequel l'arène expérimentale ou test à choix prend la forme d'un dispositif en verre en forme de Y 7. En règle générale, un bras d'un tel Y-tube recevrez un traitement odorant, tandis que l'autre sera laissé vide 13. Variations sur olfactomètres peuvent comprendre outre de multiples bras rayonnants 14 et même plus de support d'un sol pour doser le comportement des organismes mobiles à travers le sol 15. Dans l'élaboration de ces olfactomètres et essais associés, il est important de considérer à quel point les conditions naturelles sont répliquées et donc la véritable pertinence des réponses comportementales évaluées en termes de biologie des sujets du test. Pour à large mesure, les données collectées ne seront aussi utiles que la pertinence de l'essai biologique du comportement à l'égard de l'écologie comportementale de l'organisme 16.

L'olfactomètre actuellement décrites et bio-essai de comportement est spécialement conçu pour un insecte hémiptères qui tend à initier vol sous forme de courtes «saute» 16. L'orientation verticale de l'olfactomètre et le dispositif de source de lumière de faciliter le déclenchement du déplacement des insectes et donc le comportement ultérieur orientation induite chimiquement peuvent être dosés de manière efficace et avec un débit élevé. Ce dispositif d'analyse comportementale peut probablement être utilisé pour un large éventail de voler ou marcher taxons d'arthropodes ou pourrait être aussi facilement modifiés pour s'adapter à la nécessité de la non-arthropodes organismes.

Disclosures

L'auteur a reçu un financement qui a été fourni par le Citrus Research and Development Foundation.

Acknowledgments

La recherche Citrus and Development Foundation est reconnu pour fournir des fonds. Merci à Angel Hoyte et Michael Flores pour la réalisation des essais biologiques.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Two port divided T-olfactometer Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL None(Custom made) If unavailable from ARS, Southern Scientific (Gainesville, FL) also currently builds and distributes such equipment.
Solid-phase micro-extraction holding/odor source chamber with Teflon;-glass tube connectors. Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL RV-R3 See above comment
Air delivery system Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL HADS-2AFM2C.4 See above comment
Guillotine chamber Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL L3GP3 See above comment

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References

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Stelinski, L., Tiwari, S. Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants. J. Vis. Exp. (72), e50229, doi:10.3791/50229 (2013).More

Stelinski, L., Tiwari, S. Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants. J. Vis. Exp. (72), e50229, doi:10.3791/50229 (2013).

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