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Neuroscience

匂い物質へ節足動物Responseの垂直T-迷路チョイスアッセイ

doi: 10.3791/50229 Published: February 14, 2013

Summary

垂直、T迷路嗅覚は節足動物の行動反応を測定するために記載されています。嗅覚は、2つの潜在的な臭気のフィールドにさらされたとき、実験者は被験者によって行わ選択肢を測定することができます。両方の魅力と匂い物質からの反発は、この装置を用いて測定することができます。

Abstract

農作物の害虫として、昆虫やクモの経済的重要性、都市環境や植物のベクトルとヒトの疾患のように与えられた、様々な技術が制御ツールとして開発されている。これらのツールのサブセットが引力または反発力による節足動物の動作を変更するに焦点を当てています。したがって、節足動物はしばしば行動の調査の焦点です。様々なツールが風洞、フライトミル、servospheres、とolfactometersの様々なタイプを含む節足動物の行動を測定するために開発されている。これらのツールの目的は、嗅覚より頻繁に視覚や合図に昆虫やクモの応答を測定することです。ここで説明する垂直T-迷路oflactometerは誘引や忌避剤に応じて昆虫が行う選択肢を測定します。これは、正の走光性(光に引力)と、多くの節足動物によって示された負の走地性(歩いたり、上向きに飛ぶ傾向)を生かしたハイスループットアッセイ装置です。 olfactometERは、T-迷路を形成するテフロンストリップで半分に分割さ30cmのガラス管で構成されています。各半分は誘引を含むアッセイにおける二つの潜在的な臭気のフィールド間の選択をするために被験者を可能にするオルファクトメーターの腕として機能します。忌避剤を含むアッセイにおいて、既知の誘引に対する正常な反応の欠如はまた、第三の変数として測定することができる。

Introduction

彼らはどちらか、農業や都市環境における人間の消費と競合したり、病気の原因病原体1を送信するためには、節足動物(昆虫やクモ類を含む)は、多くの場合、害虫のように定義されます。多額の投資は、病害虫防除ツールの開発に作られています。これらのツールは、大きく異なる可能性があります、重要な進展がどちらの行動誘引や忌避剤2,3を利用した害虫の自然な行動を修正したり、悪用するbiorationalツールを開発してなされたものである。

節足動物害虫はしばしばメイトおよび/ ​​またはホストの場所4の嗅覚信号や合図に依存しています。そのため害虫の誘引効果や忌避剤の発見は、しばしばコントロールツールの開発につながることができます。発見のこのプロセスは、複数の手順が必要です。まず、被験者の自然な振る舞いを理解する必要があります。例えば、人が与えられた種の一つ性別が反対を引き付けるかどうかを確かめる必要があります合致位置のためのセックス。もしそうなら、1この観光名所が化学によって媒介されるとどこにその化学物質が生産されているかどうかを判断する必要があります。さらなるステップは、化学物質を製造する際に決定し、その最終的な識別情報が含まれます。この手順では、匂い物質への被験者の(昆虫やダニ)行動反応をテストする必要があります。当初、被験者の行動は、天然材料にテストされます。例えば、雄蛾の応答は、その女性の同種のフェロモン腺の抽出物のそれに試験することができる。あるいは、その宿主植物の自然な匂いに草食動物の応答を試験することができる。これらの調査は、多くの場合、管理ツール5,6の開発に関する実践的なフォーカスを持っているが、彼 ​​らはまた、分化7など、より根本的な問題を、解決し研究に適用することができます。以降の手順は、識別された天然物の合成バージョンへの節足動物の応答をテスト伴う。

U節足動物は、化学物質にどのように反応するかnderstandingすると、適切なツールの開発が彼らの行動を測定する必要があります。このようなツールによって生成されたデータは、調査員が制御された雰囲気の中で自然な行動を測定することがどれだけに依存することになる。六十年以上前に、持続的な飛行olfactometersとトンネルが匂い物質8,9の昆虫の応答を測定するために開発されました。 Olfactometersは、デザインにおいても大きく変動し、しばしば検討され、特定の昆虫や問題に合わせて調整されます。この記事の目的は、臭気物質( 図1)昆虫の応答を測定するために垂直に配向し、T迷路オルファクトメーターの設計および使用を記述することである。オルファクトメーターの垂直方向は、多くの昆虫が展示され負の走地性(上に移動する傾向)を利用しています。直接オルファクトメーターの上方に位置する光源は、多くの昆虫が展示され、正の走光性(光の源に向かって移動する傾向)を利用しています。 olfactometerは、水平指向olfactometersで容易に動きを示すように、頻繁に向きに対して光強度の影響を受けているということではない傾向がある半翅目の昆虫のために特に有用である。しかし、この装置は、飛行やクロール昆虫だけでなく、クモの広い範囲に使用することができます。嗅覚が誘引と忌避剤の両方を評価するために用いることができる。誘引の場合には、二股臭気フィールド( 図1)は、反対側に放出きれいな空気対1の側に放出推定誘引との間で確立されています。オルファクトメーターの根元に解放昆虫が2臭気のフィールドのいずれかを選択したときに選択が記録されます。防虫剤の場合には、第三動作が可能です。 2臭気フィールド、上向きの運動不足のいずれかの非応答刺激を示すまたは臭気のフィールドのいずれかから刺激を撃退記録されることがありますに上方への動きに加えて、。

Protocol

  1. 以前マンに記載のTオルファクトメーター割ったカスタム設計された、2ポートの組み立て 10は、 図1に示されています。嗅覚は、T-迷路を形成するテフロンストリップを持つ2つの別々のポートに分岐さ30cmのガラス管で構成されています。各半分は被験者は2つの潜在的な臭気のフィールド間を選択できるように2の選択肢スタイルオルファクトメーターの腕に似ています。
    1. アセンブリおよびその後のアッセイは、恒温室や環境チャンバ内で行われるべきである。
    2. マウントガラス、T-迷路の嗅覚は、垂直に、 図1に示すように、蛍光900ルクスの電球の下に配置します。
    3. 最適な光拡散については、アセンブリは、均一な光拡散を最大化するために、1.0×0.6×0.6メートル不透明容器内に設置する必要があります。
    4. 固相マイクロ抽出保持/臭気源CHAMB内に収納される臭気源に嗅覚アームを接続する·ガラス管コネクタ;テフロンを通じてER(SPMEC)(ARS社、ゲインズビル、フロリダ州)。各SPMECは、着信および発信の空気の流れ( 図1)のための入口と出口弁でサポートストレートガラス管(長さ×3.5センチ幅17.5センチメートル)で構成されています。
    5. 一定の圧力(外部ソースが使用できない場合、空気供給システムは、空気の浄化のための内部カーボンフィルターと加湿用の空気バブラーの両方を持っている)の下にある加湿と炭素浄化された空気の外部ソースへの空気供給システムを接続します。
    6. 例えば、綿芯(ペティジョン包装株式会社、コンコルド、ノースカロライナ州)のような徐放性基材上に適切な希釈剤(溶剤)、ピペット内に所望の化学的サンプルを溶解する。制御処理は溶媒のみを含浸させた綿芯で構成する必要があります。
    7. ガラス製品の重要な汚染を防止するために、(キムワイプ、キンバリークラーク、ロズウェル研究所組織で群と対照綿芯を包む、GA)と場所2 SPMEC腕(ARS社、ゲインズビル、フロリダ州)へ。ライブ植物試料の場合には、ギロチン揮発コレクション室がSPMECの場所( 図1)での治療を含むオルファクトメーターに接続することができます。
    8. 空気供給システム( 図1)に接続された2つのポンプを介してSPMEC(またはギロチン揮発室)を通して精製し、加湿された空気をお届けします。オルファクトメーターの両腕を通して0.1 L /分で空気流量を維持します。
  2. 推定上の忌避剤に節足動物の応答をテストするオルファクトメーターを採用。本明細書において、半翅目の昆虫、アジアの柑橘類キジラミ、 ミカンキジラミは 、試験節足動物として使用されました。応答は、臭気源として柑橘類の揮発性物質単独または撥(ジメチルジスルフィド)との組み合わせで、クリーンな空気にテストされています。
    1. 標準化された温度と相対湿度ですべての実験を行う。
    2. すべてのテストの前に、トンを公開estは被験者片寄りまたは被験者の挙動に対する溶媒の効果の有無を検証するために、T-迷路オルファクトメーターの空気対きれいな空気や溶剤対きれいな空気をきれいにする。
    3. 各バイオアッセイの冒頭オルファクトメーターのアームのいずれかに無作為に臭気源を割り当てます。毎年10名の被験者が位置バイアスの可能性を排除するために、最低でも、検定した後、この位置を逆にしてください。
    4. 30以上の値(および最大120)治療の組み合わせごとに被験者の応答をテストします。
    5. テストの被験者100から300秒が以前に確立されたレスポンス(レイテンシ)の間隔に基づいて行動反応を示すことができるようにします。
    6. 録音した場合の対象は、治療アーム、コントロールアームに入るか、または開放ポートに、またはT-迷路部門下回っている。
    7. 被験者がどちらの嗅覚アームに、T-迷路と動きで除算を横切るときの治療やコントロールアームの選択肢を獲得。
    8. ときに、テストのリリースアームの選択肢を獲得ubjectはリリースポート、あるいは、T-迷路部門下回っている。
    9. 2%の石鹸液で十分に嗅覚と連結管をきれいにし、別の臭気トリートメントの使用の間の200°Fのガラス成分を焼く。
    10. アッセイのために推定される撥治療はきれいな空気に対する化学的処理の有無にかかわらず、T-迷路の嗅覚で提示されている、リリース時点で残っていると分散の一方向分析によって治療間の嗅覚を入力していない被験者の数を比較( ANOVA)TukeyのHSD検定(α<0.05)が続いている。被験者がリリースアームを残している例では、α<0.05でカイ二乗(χ2)分析を用いた治療アーム対コントロールアームを選択する数を比較します。

Representative Results

彼らの出生の宿主植物揮発性物質(柑橘類)の匂いに対するアジアの柑橘類キジラミ( ミカンキジラミ )大人の魅力は、図2Aに示されている。空白(クリーンエア)対照と比較して有意に(α<0.05)より大人が生きている柑橘系の植物から悪臭を受け、T-迷路オルファクトメーターのアームを選んだ。

斥力の例は、図2Bに示されている。第二アームが知られている撥水、ジメチルジスルフィド11で処理した柑橘系の植物から揮発性物質を受けながら、このケースでは、昆虫は、T迷路受信柑橘系揮発性物質の一方のアームにさらされた。このケースでは、行動の3つのタイプが観察された。 psyllids数リリースアームで逮捕され、応答していない柑橘類の植物単独( 図2B)から悪臭を受け腕に入る数から統計的な差は認められなかった。ただし、psyllidsは、tを含む腕を入力しない( 図2B)撥と共存提示されたとき、彼は揮発性の植物をホストします。

図1
図1。垂直に配向し、T-迷路オルファクトメーターの概略図は、空気供給システムおよび臭気処理のリリースデバイスに入社しました。図はMann 図1を適応したものです10。被験者は、Tオルファクトメーター分割2ポートのリリース室に個別に配置されます。それは嗅覚に制御上方への移動を可能にし、リリースポイントのエリアに戻ってクロールから昆虫を防ぐゲートバルブを介して匂いに向かって移動します。チューブは10cmゲート値の後に分岐する。昆虫部門の特定の側面に0.5cmの移動に一度臭気への積極的な応答が記録されます。ギロチン揮発収集チャンバーは固体PHAの代わりに使用することができる臭気源として電子マイクロ抽出保持/臭気源室(SPMEC)。

図2
図2(B)は 、垂直に配向Tにおける柑橘類の宿主植物対クリーンエア制御(A)または柑橘類の揮発性物質に対する柑橘系揮発性物質から揮発性物質を撥(ジメチルジスルフィド)と同時リリースにアジア柑橘類キジラミ( ミカンキジラミ )大人の対応迷路嗅覚図2A:TukeyのHSD検定(α<0.05)が続いて一元配置分散分析(ANOVA)はキジラミのいずれアーム(2トリートメント、N = 120)の間で選択を行うの数を比較するために行われた。別の文字で示された列は、互いに(α<0.05)と有意に異なっている図2B:片道analysTukeyのHSD検定(α<0.05)が続いて分散分析(ANOVA)であるが、腕やリリースポイントに残っている(3トリートメント、N = 120)のいずれかの間で選択を行うキジラミの数を比較するために行われた。別の文字で示された列は、互いに(α<0.05)と有意に異なっている。

Discussion

匂い物質へここに、分析デバイスとプロトコルは小さな節足動物(キジラミ科:半翅目昆虫綱)の応答を測定するために記載されている。この方法は、昆虫が誘引推定を評価するアッセイの場合には2つの着臭剤のフィールド間の選択をすることができ、選択のテストが含まれます。さらに、被験者は撥アッセイの場合には、リリースアームを残し、二つの潜在的な臭気のいずれかのフィールドのいずれかを入力するか、リリースアーム内に残っていることによって行動の3つのタイプが表示される場合があります。それは負の走地性の(上方へ移動する傾向)と正の走光(光に向かって移動する傾向)多くの節足動物の自然な行動反応を利用していますので、嗅覚は、高スループットのデータ収集が可能になります。本デモンストレーションでは、昆虫キジラミテストの例を使用していますが、このアッセイは、容易に、広く節足動物へのフライトを使用するもの又は交通の優勢なモードとしてウォーキングの両方を適合させることができます。

12を解明する上で大きな役割を果たしてきました。そのようなolfactometersの特定の設計は大きく異なるが、2つの選択肢のアッセイの一般的なテーマのバリエーションは、同様のY字型チューブアッセイは、しばしば化学物質への節足動物の反応を測定するために使用されてきたが、同様に、ここで説明する。昆虫9の持続飛行を引き起こす可能性があり大きな飛行トンネルはまた害虫駆除ツールの実用化を知らせる基本セミオケミカルに昆虫の飛行及び配向のメカニズムだけでなく、データを解明する画期的なデータの収集につながった。

それは多くの場合、特定の節足動物被験者の生物学のためのオルファクトメーターとそれに関連する計装仕立てる設計する必要がある。昆虫の一般的なグループの間で使用することができるものolfactometersどれがスペックよりも便利です小グループにIFICますが、時には虫の小グループの経済的意義は非常に特異的嗅覚とアッセイ技術の開発の必要性を決定します。現在記載された設計は、以前はおなじみの節足動物の技術の上に成り立っています。これは実験的なアリーナや選択テストはY字型のガラス装置7の形態をとるY字管のバイオアッセイよりも標準の2選択肢のアッセイが可能になります。他は13空白のままになりますが、通常、このようなY字管の一方のアームは、治療臭気物質を受け取ることになります。そのようなolfactometersのバリエーションには、複数の放射アーム14の加算とさえ土壌15を通って移動する生物の行動を分析するための土壌培地の添加を含むことができる。そのようなolfactometersおよび関連アッセイを開発する上で、それは、このように試験科目 "生物学の観点から評価した行動応答の真の妥当性、自然条件が複製されどのように密接に考慮することが重要であると。 LAにRGE度は、収集されたデータのみが生物の行動生態学16に対する行動のバイオアッセイの妥当性などとして有用であろう。

現在説明嗅覚と行動バイオアッセイは、特に短い"ジャンプ" 16として飛行を開始する傾向が半翅目の昆虫のために設計されています。オルファクトメーターの垂直方向と光源配置は、昆虫の動きの開始を促進するため、その後の化学的媒介定位行動を効率的かつ高スループットで測定することができる。この行動アッセイ配置はおそらく飛行や節足動物の分類群を歩いたり、また、簡単に非節足動物生物の必要性に合わせて変更される可能性の広範な配列を用いることができる。

Disclosures

著者はシトラス研究開発財団によって提供された資金を受け取った。

Acknowledgments

シトラス研究開発財団が資金を提供するために承認されています。バイオアッセイを実施するためのエンジェル·ホイトとマイケル·フローレスに感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Two port divided T-olfactometer Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL None(Custom made) If unavailable from ARS, Southern Scientific (Gainesville, FL) also currently builds and distributes such equipment.
Solid-phase micro-extraction holding/odor source chamber with Teflon;-glass tube connectors. Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL RV-R3 See above comment
Air delivery system Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL HADS-2AFM2C.4 See above comment
Guillotine chamber Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL L3GP3 See above comment

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References

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Stelinski, L., Tiwari, S. Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants. J. Vis. Exp. (72), e50229, doi:10.3791/50229 (2013).More

Stelinski, L., Tiwari, S. Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants. J. Vis. Exp. (72), e50229, doi:10.3791/50229 (2013).

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