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Neuroscience

Odorants에 Arthropod 응답을 수직 T-미로 초이스 분석

doi: 10.3791/50229 Published: February 14, 2013

Summary

수직, T-미로 olfactometer는 절지 동물의 행동 반응을 시금에 설명되어 있습니다. olfactometer은 두 잠재적 인 냄새 필드에 대상이 때 실험은 실험 대상으로 수행 선택권을 측정 할 수 있습니다. 모두 인력과 odorants의 반발이 장치와 함께 측정 할 수 있습니다.

Abstract

농업 작물, 도시 환경이나 식물과 인간 질병의 벡터 등의 해충 등의 곤충, 그의 거미의 경제적 중요성을 감안할 때, 다양한 기술은 제어 도구로 개발되고있다. 이러한 도구의 하위 집합 인력이나 반발력에 의해 절지 동물의 동작을 수정에 초점을 맞추고 있습니다. 따라서, 절지 동물은 종종 행동 조사의 초점입니다. 다양한 도구가 바람 터널, 비행 공장, servospheres, 그리고 olfactometers의 다양한 형식을 포함 arthropod 행동을 측정하기 위해 개발되었습니다. 이 도구의 목적은 후각 더 자주 시각적 또는 신호에 곤충이나 거미류의 동물 응답을 측정하는 것입니다. 여기에 설명 된 수직 T-미로 oflactometer는 attractants 또는 방충제에 대한 응답으로 곤충에 의해 수행 선택권을 측정합니다. 그것은 긍정적 인 phototaxis (빛에 매력)과 많은 절지 동물에 의해 전시 부정적인 geotaxis (도보 또는 위쪽으로 비행 성향)을 활용 높은 처리량 분석 장치입니다. olfactomet응급실은 T-미로를 형성 테플론 스트립을 반으로 나누어 져 있습니다 30cm 유리관으로 구성되어 있습니다. 각 반은 시험 과목 attractants을 포함한 assays에 두 개의 잠재적 인 냄새 필드 사이 선택을 할 수있게 olfactometer의 팔 역할을합니다. 방충제와 관련된 assays에서 알려진 attractants에 대한 정상적인 반응의 부족은 또한 삼분의 일 변수로 측정 할 수 있습니다.

Introduction

그들은 어느 농업 또는 도시 설정에 인간이 소비와 경쟁 또는 질병 1 인과 병원균을 전송하기 때문에 절지 동물은 (곤충, 그의 거미 포함) 종종 해충으로 정의됩니다. 투자의 큰 금액은 같은 해충에 대한 제어 도구의 개발에 구성되어 있습니다. 이 도구는 다양하고 중요한 진행 중 수정하거나 행동 attractants 또는 방충제 2,3의 사용과 해충의 자연 동작을 이용 biorational 도구를 개발하였습니다.

Arthropod 해충은 종종 친구 및 / 또는 호스트 위치 4에 대한 후각 신호 또는 신호에 의존하고 있습니다. 따라서 해충에 효과 attractants 또는 방충제의 발견은 종종 제어 도구의 개발로 이어질 수 있습니다. 발견이 과정은 여러 단계를 포함한다. 첫째, 실험 대상의 자연 동작을 이해해야합니다. 예를 들어, 하나는 주어진 종의 하나의 성별이 반대를 받고 있는지 여부를 확인할해야합니다동료 위치 섹스. 그렇다면, 이러한 매력이 화학 물질에 의해 중재되어있는 그 화학 물질이 생성되어 있는지 확인해야합니다. 또한 단계는 화학 물질이 생성 될 때 결정 및 최종 식별 할 수 있습니다. 이 절차를 통해 odorants에 테스트 대상의 (곤충이나 진드기) 행동 반응을 테스트해야합니다. 처음 테스트 피사체의 동작은 천연 소재로 테스트됩니다. 예를 들어, 남성 나방의 반응은의의 여성 conspecific 페로몬 샘의 추출물의로 테스트 할 수 있습니다. 또는, 그 호스트 식물의 자연적인 냄새에 herbivore의 반응을 테스트 할 수 있습니다. 이 조사는 자주 관리 도구 5,6의 개발에 실질적인 초점을 가지고 있지만, 그들은 또한 분화 7과 같은 더 근본적인 질문을 해결 연구에 적용 할 수 있습니다. 이후 단계는 확인 된 자연 제품의 합성 버전 arthropod의 응답을 테스트하는 방식입니다.

유절지 동물이 화학 물질에 반응하는 방법 nderstanding 것은 적절한 도구의 개발 행동을 측정해야합니다. 이러한 도구에 의해 생성 된 데이터는 탐정이 통제 된 환경에서 자연 행동을 측정 할 수 있습니다 얼마나 잘에 따라 달라집니다. 에 6 년 전, 지속적인 비행 olfactometers 및 터널은 odorants 8,9에 곤충 응답을 측정하기 위해 개발되었다. Olfactometers 디자인에 상당히 다를 종종 조사중인 특정 곤충이나 문제에 맞게 조정됩니다. 이 문서의 목적은 odorants (그림 1)에 곤충 응답을 측정하기위한 수직 배향, T-미로 olfactometer의 디자인 및 사용을 설명하는 것입니다. olfactometer의 수직 방향은 많은 곤충에 의해 전시를 제외 geotaxis (최대 이동 경향)을 활용합니다. 직접 olfactometer 위에 위치 광원은 많은 곤충에 의해 전시 긍정적 인 phototaxis (빛의 소스쪽으로 이동하는 경향)을 활용합니다. olfactometer는 가로 지향 olfactometers에서 쉽게 운동을 전시하고 크게 방향에 대하여 빛의 세기에 의해 영향을받습니다 해당하지 않는 경향이 hemipteran 곤충에 특히 유용합니다. 그러나,이 장치는 비행과 크롤링 곤충뿐만 아니라 그의 거미의 다양한 사용할 수 있습니다. olfactometer는 attractants와 방충제를 모두 평가하는 고용 할 수 있습니다. attractants의 경우, 분기 냄새 필드 (그림 1) 반대편에 발표 깨끗한 공기 비해 한쪽에 릴리스 된 putative 유인으로 설립되어 있습니다. olfactometer의 밑바닥에 발표 된 곤충은 두 냄새 필드 중 하나를 선택하면 선택이 기록되어 있습니다. 방충제의 경우, 세 번째 동작은 가능합니다. 두 악취 분야 상방으로 이동하는 부족 중 하나가 아닌 응답 자극을 나타내는 또는 냄새 분야 중 하나에서 자극을 repelling 기록 될 수 있습니다에 상방으로 이동뿐만 아니라.

Protocol

  1. 조립 두 포트 나누어 맞춤 설계 T-olfactometer 이전에 맨 외에 설명되어 있습니다. 10 그림 1에 표시됩니다. olfactometer는 T-미로를 형성 테플론 스트립 두 개의 별도의 포트로 분기되는 30cm 유리관으로 구성되어 있습니다. 각 반은 실험 대상은 두 잠재적 인 냄새 분야 중 하나를 선택 할 수 있도록 2 선택 스타일 olfactometer의 팔에 유사하다.
    1. 조립 및 이후 assays는 온도 조절 객실이나 환경 챔버 내에서 자리를 차지해야합니다.
    2. 마운트 유리 T-미로 olfactometer는 수직으로 그림 1에 표시되고 형광등 900 룩스 전구 아래 위치를.
    3. 최적의 광 확산를 들어, 어셈블리 X 0.6 m 불투명 한 용기는 균일 한 빛의 확산을 최대화하기 위해 1.0 X 0.6 내에 장착해야합니다.
    4. 고체 상 마이크로 추출 유지 / 악취 소스 chamb에 자리 잡고됩니다 악취 소스에 olfactometer의 팔을 연결유리 튜브 커넥터, 테플론을 통해 어 (SPMEC) (ARS 주식회사, 게인즈 빌, 플로리다). 각 SPMEC는 수신 및 발신 공기 흐름 (그림 1) 입구와 출구 밸브를 지원 직선 유리관 (x 3.5 cm 폭 17.5 cm 길이)로 구성되어 있습니다.
    5. 일정한 압력 (외부 소스를 사용할 수없는 경우 공기 공급 시스템은 가습에 공기 정화를위한 내부 카본 필터 및 공기 버블을 모두 갖추고 있습니다) 아래에 humidified 및 탄소 정화 공기의 외부 소스에 공기 전달 시스템을 연결합니다.
    6. 이러한면 심지 (상사 존 포장 주식회사, 콩코드, NC)와 같은 느린 릴리스 기판에 적절한 희석제 (용제) 및 피펫 내에 원하는 화학 물질 샘플을 분해. 제어 치료는 용매를 임신면 심지로 구성해야합니다.
    7. 유리의 상당 오염을 방지하기 위해 연구소 조직의 처리 및 제어면 wicks을 (Kimwipes, 킴벌리 - 클락, 그곳이 싸다, GA)과 두 SPMEC 암 (ARS 주식회사, 게인즈 빌, FL)에 위치. 라이브 식물 샘플의 경우, 단두대 휘발성 수집 챔버는 SPMEC 장소 (그림 1)에서 트리트먼트를 포함하는 olfactometer에 부착 할 수 있습니다.
    8. 정화 및 공기 전달 시스템 (그림 1)에 연결된 두 개의 펌프를 통해 SPMEC (또는 단두대 휘발성 챔버)를 통해 humidified 공기 제공합니다. 0.1 L / olfactometer의 팔 모두를 통해 분에서 공기 흐름 속도를 유지하고 있습니다.
  2. putative 방충제로 arthropod 응답을 테스트 할 olfactometer을 채용. 현재 설명에 hemipteran의 곤충, 아시아 감귤 psyllid, Diaphorina citri는 테스트 arthropod로 사용되었다. 응답 감귤 휘발성 물질 단독으로 또는 조합에 혐오감을 (디메틸 이황화) 및 악취 소스로 깨끗한 공기로 테스트되었습니다.
    1. 표준화 된 온도 및 상대 습도의 모든 실험을 실시한다.
    2. 전에 모든 테스트에, t에 노출동부 표준시는 과목 위치 편견 또는 테스트 피사체의 동작에 대한 용매의 효과의 부재를 확인하기 위해 T-미로 olfactometer의 공기 대 깨끗한 공기 또는 용매 대 깨끗한 공기를 청소합니다.
    3. 무작위로 각 bioassay의 시작 부분에 olfactometer의 팔 중 하나에 냄새 소스를 지정합니다. 매 10 시험 과목 assayed 후 위치 편견의 가능성을 제거하기 위해, 최소한이 위치를 반대로.
    4. 30 최소 (및 최대 120까지) 치료의 조합을 당 시험 과목의 응답을 테스트합니다.
    5. 시험 과목 100-300 초 이전에 설립 응답 (지연 시간) 간격에 따라 행동 반응을 전시 할 수 있도록 허용합니다.
    6. 녹음해도 주제는 치료 암, 컨트롤 팔을 입력하거나 릴리스 포트 또는 T-미로 사업부 아래에 남아 있습니다.
    7. 실험 대상은 T-미로 있으며 olfactometer 암에 이동에 부서를 횡단 할 때 치료 또는 제어 무장 선택을 점수.
    8. 때 시험의 릴리스 암 선택을 점수ubject는 출시 포트 또는 T-미로 사업부 아래에 남아 있습니다.
    9. 2 % 비누 솔루션을 철저하게 olfactometer 및 연결 관을 청소하고 다른 냄새 트리트먼트의 사용 사이에 200 ° F에서 유리 구성 요소를 구워.
    10. putative 방충제 치료가 함께 또는 깨끗한 공기 대 화학 처리없이 T-미로 olfactometer에서 제공되는 assays를 들어, 릴리스 시점에서 나머지 시험 과목의 수를 비교하고 트리트먼트 사이의 olfactometer을 분산하는 방법 중 하나 분석에 의해 입력하지 ( ANOVA) Tukey의 HSD 검사 (α <0.05)이 나타납니다. 시험 과목은 릴리스 팔을두고있는 경우에, 치 평방 (χ 2) α <0.05에서 분석 치료 암 비해 제어 팔을 선택 숫자를 비교합니다.

Representative Results

자신의 출생의 호스트 식물 휘발성 물질 (감귤류)의 냄새에 아시아 감귤류 psyllid (Diaphorina citri) 성인의 매력은 그림 2A에 그려져 있습니다. 빈 (깨끗한 공기) 제어와 비교 크게 (α <0.05) 더 성인 생활 감귤류 식물의 냄새를 수신하는 T-미로 olfactometer의 팔을 선택했습니다.

반발의 예는 그림 2B에 표시됩니다. 두 번째 팔이 알려진 구충제, 디메틸 이황화 11 처리 된 감귤류 공장에서 휘발성 물질을받은 반면이 경우 곤충은 T-미로 수신 감귤 휘발성 물질 중 하나 팔에 노출되었다. 이 경우, 행동의 세 가지 유형이 관찰되었다. 릴리스 팔에 체포 혼자 감귤류 식물 (그림 2B)에서 악취를받는 팔을 들어 수에서 통계적으로 차이가 안 응답하지 psyllids의 수입니다. 그러나, 더 psyllids는 t를 포함하는 팔을 입력하지(그림 2B) 방충제와 함께 공동 발표 때이 휘발성 공장을 개최했습니다.

그림 1
1 그림. 수직 배향 된 T-미로 olfactometer의 개략도는 공기 전달 시스템과 냄새 치료 릴리스 장치에 합류했습니다. 다이어그램 맨 외에도 1의 적응이다. 10. 실험 대상은 2 포트 나누어 T-olfactometer의 릴리스 챔버에 개별적으로 배치됩니다. 이 olfactometer으로 제어 상방으로 이동이 가능하고 릴리스 포인트 지역에 다시 크롤링에서 곤충을 방지하는 게이트 밸브를 통해 냄새를 향해 이동합니다. 튜브 게이트 값이 후 10 센티미터 bifurcates. 곤충이 부서의 특정 측면에 0.5 cm 이동 후 냄새에 대한 긍정적 인 반응이 기록되어 있습니다. 기요틴 휘발성 수집 챔버는 고체 phas 대신 사용할 수 있습니다악취 소스로 전자 마이크로 추출 지주 / 악취 소스 챔버 (SPMEC).

그림 2
그림 2. (B) 수직 배향 된 T에서 감귤류 호스트 식물 대 깨끗한 공기 제어 (A) 또는 감귤 휘발성 물질 대 감귤 휘발성 물질의 휘발성 물질 방충제 (디메틸 이황화)와 공동 출시로 아시아 감귤류 psyllid (Diaphorina citri) 성인의 응답 - 미로 olfactometer 그림 2A :. Tukey의 HSD 검사 (α <0.05)에 이어 분산의 편도 분석 (ANOVA)을 psyllid 어느 팔 (2 트리트먼트, N = 120) 사이의 선택을 만드는 수를 비교하기 위해 수행되었다. 다른 글자로 표시 열은 다른 (α <0.05) 한에서 크게 다른 그림 2B :. 편도 분석가Tukey의 HSD 검사 (α <0.05)에 이어 차이 (ANOVA)입니다이 psyllid은 릴리스 포인트에서 하나 팔이나 남아 (3 트리트먼트, N = 120) 사이의 선택을 만드는 수를 비교하기 위해 수행되었다. 다른 글자로 표시 열이 서로 (α <0.05)에서 크게 다릅니다.

Discussion

odorants에 언급, 분석 장치 및 프로토콜은 작은 절지 동물 (Psyllidae : Hemiptera Insecta)의 반응을 측정하기위한 설명되어 있습니다. 방법은 곤충이 putative 유인을 평가 assays의 경우에 두 개의 odorant 분야 사이의 선택을 할 수 있도록 선택 시험을 포함한다. 또한, 테스트 대상이 repellency의 assays의 경우, 릴리스 팔에 릴리스 팔을 떠나는 두 잠재적 인 냄새 분야 중 하나를 입력하거나, 남은 의해 행동의 세 가지 유형을 표시 할 수 있습니다. 그것이 부정적인 geotactic (위쪽으로 이동하는 경향)과 긍정적 인 phototactic (빛을 향해 이동하는 경향) 많은 절지 동물 자연 행동 반응을 이용하기 때문에 olfactometer는 높은 처리량 데이터 수집 할 수 있습니다. 현재 데모가 psyllid 곤충 테스트 예제를 사용하지만, 검정은 쉽게, 크게 절지 동물로 비행을 사용하는 사람들이나 교통 주된 수단으로 도보를 모두 적용 할 수 있습니다.

12 elucidating의 주요 역할을하고 있습니다. 이러한 olfactometers의 특정 디자인은 다양하지만, 두 선택 분석의 일반적인 주제에 대한 변화는 유사한 Y-관 assays은 종종 화학 물질에 대한 arthropod 응답을 측정하기 위해 사용 된뿐만 아니라, 여기에 설명. 곤충 9 지속적인 비행의 원인이 될 수 있습니다 큰 비행 터널은 해충 제어 도구의 활용을 알리는 기본 semiochemicals에 곤충 비행 및 방향의 메커니즘뿐만 아니라, 데이터를 elucidating 혁신적인 데이터 수집 결과했습니다.

이 맞춤 설계 종종 특정 arthropod 테스트 피사체의 생물에 대한 olfactometer 및 관련 장비가 필요합니다. 사람들이 브리핑을보다 곤충의 일반 그룹 중 사용할 수있는 이러한 olfactometers 더 유용합니다작은 그룹에 ific하지만, 때로는 곤충의 작은 그룹의 경제 중요성은 매우 구체적인 olfactometer 및 검정 기술의 개발에 대한 필요성을 결정합니다. 현재 기술 설계는 이전에 익숙한 arthropod 기술을 구축합니다. 이 실험 분야 또는 선택 시험은 Y 모양의 유리 장치 (7)의 형태로 발생하는 Y-관 bioassays보다 표준 두 선택 분석 할 수 있습니다. 다른는 13 비워 둘 수는 있으나 일반적으로, 이러한 Y-관의 팔 하나는 치료 odorant을 받게됩니다. 이러한 olfactometers에 유사 콘텐츠는 여러 방사 무기 (14)의 추가, 심지어 토양 15 일까지 이동하는 생물체의 동작을 시금위한 토양 매체의 추가를 포함 할 수 있습니다. 이러한 olfactometers 및 관련 assays을 개발에서는 자연 조건이 테스트 대상 '생물학의 관점에서 평가 행동 반응의 진정한 관련성을 복제하기 때문에하는 방법을 면밀히 고려하는 것이 중요합니다. LA로rge 학위는 수집 된 데이터는 유기체의 행동 생태학 16와 관련하여 행동 bioassay의 관련성만큼 유용 할 것입니다.

현재 설명 olfactometer 및 행동 bioassay은 특히 짧은 "점프"16으로 비행을 시작하는 경향이 hemipteran 벌레를 위해 설계되었습니다. olfactometer의 수직 방향 및 광원 배치는 곤충 운동의 개시를 촉진하므로 후속 화학적으로 인한 방향 동작 효율적이고 높은 처리량과 assayed 할 수 있습니다. 이 행동 검정 배열은 가능성이 날아 나 arthropod taxa 도보 나 또한 쉽게 비 arthropod 생물의 필요에 맞게 수정이 될 수의 다양한 배열에 사용할 수 있습니다.

Disclosures

저자는 감귤 연구 및 개발 재단이 제공 한 자금을 받았습니다.

Acknowledgments

감귤 연구 및 개발 재단은 기금을 제공하는 인정합니다. bioassays을 실시 천사 Hoyte과 마이클 플로레스에게 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Two port divided T-olfactometer Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL None(Custom made) If unavailable from ARS, Southern Scientific (Gainesville, FL) also currently builds and distributes such equipment.
Solid-phase micro-extraction holding/odor source chamber with Teflon;-glass tube connectors. Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL RV-R3 See above comment
Air delivery system Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL HADS-2AFM2C.4 See above comment
Guillotine chamber Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL L3GP3 See above comment

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References

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Stelinski, L., Tiwari, S. Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants. J. Vis. Exp. (72), e50229, doi:10.3791/50229 (2013).More

Stelinski, L., Tiwari, S. Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants. J. Vis. Exp. (72), e50229, doi:10.3791/50229 (2013).

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