Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Vertikal T-labyrint Val analys för Arthropod svar på luktämnen

doi: 10.3791/50229 Published: February 14, 2013

Summary

En vertikal T-labyrint olfaktometer beskrivs för analys av beteendemässiga responsen hos leddjur. Den olfaktometer gör försöksledaren mäta val utförs av försökspersoner när de utsätts för två potentiella lukt fält. Både dragning till och repulsion från doftämnen kan mätas med den här enheten.

Abstract

Med tanke på den ekonomiska betydelse insekter och spindeldjur som skadedjur av jordbruksgrödor, urbana miljöer eller som vektorer av vegetabiliskt och mänskliga sjukdomar, är olika teknologier utvecklas som kontrollverktyg. En undergrupp av dessa verktyg är inriktad på att ändra beteendet hos leddjur genom attraktion eller repulsion. Därför leddjur ofta i fokus för beteendemässiga undersökningar. Olika verktyg har utvecklats för att mäta leddjur beteende, inklusive vindtunnlar, flyg kvarnar, servospheres, och olika typer av olfactometers. Syftet med dessa verktyg är att mäta insekt eller spindeldjur svar på visuella eller oftare olfaktoriska signaler. Den vertikala T-labyrint oflactometer beskrivs här mäter val utförs av insekter som svar på attraherande eller repellerande medel. Det är en hög genomströmning analysanordning som tar fördel av den positiva phototaxis (attraktion till ljus) och negativa (geotaxis tendens att gå eller flyga uppåt) uppvisas av många artropoder. Den olfactometER består av en 30 cm glasrör som är uppdelat i två halvor med en Teflon band som bildar en T-labyrint. Varje halv fungerar som en gren av olfaktometer gör försökspersonerna att göra ett val mellan två möjliga lukt fält i analyser där lockämnen. I analyser involverar repellenter, kan brist på normalt svar på kända lockämnen också mätas som en tredje variabel.

Introduction

Leddjur (inklusive insekter och spindeldjur) definieras ofta som skadedjur, eftersom de antingen konkurrerar med livsmedel i jordbruks-eller stadsmiljö eller överföra kausala patogener av sjukdom 1. En stor mängd investeringar görs i utveckling av kontrollverktyg för sådana skadedjur. Dessa verktyg kan variera kraftigt och betydande framsteg har gjorts i utvecklingen av biorational verktyg som antingen ändra eller utnyttja naturliga beteende skadedjur med hjälp av beteendemässiga attraherande eller repellerande 2,3.

Artropodskadedjur ofta beroende lukt signaler eller ledtrådar för mate och / eller värd plats 4. Därför upptäckten av effektiva lockmedel eller repellenter för skadedjur kan ofta leda till utveckling av kontrollverktyg. Denna process upptäckt involverar flera steg. Först måste den naturliga beteende testpersonen förstås. Till exempel måste en undersöka om det ena könet av en given art lockar motsattasex för mate plats. Om så är fallet, måste man bestämma huruvida denna attraktion medieras av en kemisk och där kemikalien produceras. Ytterligare steg har bestämma när kemikalien produceras och dess eventuella identifiering. Under hela denna procedur måste testpersonens (insekt eller kvalster) beteendemässiga reaktion på luktämnen testas. Initialt kommer beteende testpersonen testas för det naturliga materialet. Till exempel kan en manlig fjäril svar testas den för extraktet av den kvinnliga conspecific s feromoner körtel. Alternativt kan en växtätare svar på de naturliga lukter av dess värdväxt testas. Även dessa undersökningar har ofta en praktisk inriktning på utveckling av verktyg 5,6, kan de också tillämpas på forskning som behandlar mer grundläggande frågor, såsom artbildning 7. Efterföljande steg innebär testa leddjur svar på syntetiska versioner av identifierade naturliga produkter.

Understanding hur leddjur svarar på kemikalier kräver utveckling av lämpliga verktyg för att mäta sitt beteende. De data som genereras av sådana verktyg kommer att bero på hur väl undersökaren kan mäta naturliga beteenden i en kontrollerad miljö. Över sex decennier sedan, långvariga flygningar olfactometers och tunnlar utvecklats för att mäta insekt svar på luktämnen 8,9. Olfactometers varierar kraftigt i design och är ofta anpassade till den specifika insekten eller problem som undersöks. Målet med denna artikel är att beskriva utformningen och användningen av ett vertikalt orienterat, T-labyrint olfaktometer för mätning insekt svar på luktämnen (figur 1). Den olfaktometer vertikala orientering drar fördel av den negativa geotaxis (tendens att röra sig uppåt) som uppvisas av många insekter. En ljuskälla placerad direkt ovanför olfaktometer utnyttjar den positiva phototaxis (tendens att röra sig i riktning mot ljuskällan) som uppvisas av många insekter. Den olfactometer är särskilt användbar för hemipteran insekter som tenderar att inte uppvisa rörelse lätt i horisontellt orienterade olfactometers och som är starkt påverkade av ljusintensitet med avseende på orientering. Emellertid kan denna anordning användas för ett brett spektrum av flygande och krypande insekter, samt spindeldjur. Den olfaktometer kan användas för att utvärdera både tilldragande och repellerande medel. När det gäller attraherande är den förgrenade lukt fältet (Figur 1) upprättats med den förmodade lockmedel släpptes på ena sidan mot ren luft släpps på motsatt sida. Ett val redovisas när insekten släpps vid basen av olfaktometer väljer en av de två lukt fälten. I fallet repellenter, är tredjedel beteende möjlig. Förutom uppåtgående rörelse till endera av de två fälten lukt, avsaknad av uppåtgående rörelse kan registreras indikerar en icke-responsiv stimulans eller repellerande stimulans från antingen lukt fält.

Protocol

  1. Montering av en specialdesignad, två-port delat T-olfaktometer tidigare beskrivits i Mann et al. Visas i figur 1 10. Den olfaktometer består av en 30 cm glasrör som är förgrenad i två separata portar med en Teflon band som bildar en T-labyrint. Varje halv är analogt med en arm av en 2-val stil olfaktometer gör testpersonen att välja mellan två möjliga lukt fält.
    1. Montering och efterföljande analyser bör ske inom en temperatur-kontrollerat rum eller miljökammare.
    2. Mount glas T-labyrint olfaktometer vertikalt såsom visas i figur 1 och placera den under ett fluorescerande 900 lux glödlampa.
    3. För optimal ljusspridning, bör vara monterad inuti en 1,0 x 0,6 x 0,6 m ogenomskinlig behållare för att maximera jämn ljusspridning.
    4. Anslut olfaktometer vapen till lukt källor som kommer att inrymmas i fast fas mikro-extraktion anläggning / lukt källa CHAMBER (SPMEC) (ARS, Inc., Gainesville, FL) via Teflon,-glasrör kontakter. Varje SPMEC består av en rak glasrör (17,5 cm lång x 3,5 cm bred) stöds med en inlopps-och utloppsventil för inkommande och utgående luftströmmarna (figur 1).
    5. Anslut systemet lufttillförsel till en extern källa av fuktad och kol-renad luft som är under konstant tryck (luft leverans systemet har både en intern kolfilter för luftrening och en luft bubblare för befuktning om externa källor är tillgängliga).
    6. Lös önskade kemiska prover inom lämpligt spädningsmedel (lösningsmedel) och pipettera till en långsam frisättning substrat såsom en bomull veke (Petty John Packaging, Inc., Concord, NC). Kontrollen behandlingen bör bestå av en bomull veke impregnerad med vätska bara.
    7. För att förhindra betydande kontaminering av glas, omsluter de behandlade och kontroll bomull vekar i laboratorium vävnad (Kimwipes, Kimberly-Clark, Roswell, Georgien) och plats i de två SPMEC armarna (ARS, Inc., Gainesville, FL). När det gäller levande växter prover kan en giljotin flyktig uppsamlingskammare bifogas olfaktometer innehåller behandlingar i stället för SPMEC (figur 1).
    8. Leverera renad och fuktad luft genom SPMEC (eller giljotin flyktig kammare) via två pumpar som är anslutna till ett luft-avgivningssystem (figur 1). Bibehåll luftflöde vid 0,1 l / min genom båda armar olfaktometer.
  2. Användning olfaktometer att testa leddjur respons på förmodade repellenter. I föreliggande beskrivning har en hemipteran insekt, asiatisk citrus psyllid, Diaphorina citri, som används som ett test leddjur. Svar testades för citrus flyktiga enbart eller i kombination med en bortstötande (dimetyldisulfid) och ren luft som lukt källor.
    1. Genomföra alla experiment vid ett standardiserat temperatur och relativ fuktighet.
    2. Innan alla tester, exponera test ämnen till ren luft kontra ren luft eller lösningsmedel kontra ren luft i T-labyrinten olfaktometer att kontrollera frånvaron av positionella partiskhet eller en effekt av lösningsmedel på beteende testpersonen.
    3. Tilldela en lukt källa slumpmässigt till en av armarna i olfaktometer vid början av varje bioanalys. Vända denna position efter varje 10 försökspersoner analyserades, åtminstone, för att eliminera risken för positionella partiskhet.
    4. Testa svaret av minst 30 (och upp till 120) försökspersoner per behandling kombination.
    5. Låt försökspersoner 100-300 sek för att uppvisa ett beteende svar baserat på tidigare fastställda svar (latens) intervall.
    6. Post om ämnet kommer in i behandlingen arm, kontroll arm eller stannar kvar i Release port eller under T-labyrinten divisionen.
    7. Poäng en behandling eller kontroll armen val när en försöksperson korsar uppdelningen i T-labyrinten och flyttar in någon olfaktometer arm.
    8. Gör ett val frigivning arm när ett test ärm inte annat följer kvar i frisättning hamn eller under T-labyrint divisionen.
    9. Rengör olfaktometer och anslutande rör noggrant med 2% tvållösning och baka glaskomponenter vid 200 ° C mellan användningen av olika lukt behandlingar.
    10. För analyser som förmodade avstötande behandlingar presenteras i T-labyrinten olfaktometer med eller utan kemisk behandling kontra ren luft, jämföra antalet försökspersoner kvar vid utsläpp punkten och inte in i olfaktometer mellan behandlingarna med ett sätt variansanalys ( ANOVA) följt av Tukeys HSD-test (α <0,05). I de fall i vilka försökspersonerna lämnar frigöringsarmen, jämföra antalet välja styrarmen kontra behandling armen med Chi kvadrat (χ 2) analys på α <0,05.

Representative Results

Attraktion av asiatiska citrus psyllid (Diaphorina citri) vuxna till lukter av deras förlossning flyktiga värdväxt (citrus) visas i figur 2A. Signifikant (α <0,05) fler vuxna valde armen av T-labyrinten olfaktometer emot lukter från levande citrus växter jämfört med en blank (ren luft) kontroll.

Ett exempel av repulsion visas i figur 2B. I detta fall, var insekterna exponerades för en arm av T-maze mottagande citrusfrukter flyktiga, medan den andra armen erhöll flyktiga ämnen från en citrus växt som behandlades med den kända avstötande, dimetyldisulfid 11. I detta fall har tre typer av beteenden observeras. Antalet psyllids greps vid frigöringsarmen och inte svarar inte skiljer statistiskt från antalet in i armemottagande lukt från citrus växter enbart (Figur 2B). Men in några psyllids armen innehåller tHan värdväxt flyktiga vid samtidig presenteras med repellent (Figur 2B).

Figur 1
Figur 1. Skiss av vertikalt orienterade T-labyrint olfaktometer sammanfogade till luft avgivningssystemet och lukt behandlingsanordningar frisättning. Diagrammet är en anpassning av fig 1 i Mann et al. 10. En försöksperson placeras individuellt i frisläppandet kammare delat 2-port T-olfaktometer. Den rör sig mot lukter genom en grind ventil som möjliggör kontrollerade rörelse uppåt i olfaktometer och förhindrar insekten från krypa tillbaka in i släppunkt området. Röret förgrenar 10 cm efter porten värdet. Ett positivt svar på en lukt registreras när insekten flyttar 0,5 cm till ett specifikt sida av indelningen. Giljotinen flyktiga uppsamlingskammare kan användas i stället för en fast-phase mikro-utvinning innehav / lukt jonisationskammare (SPMEC) som en lukt källa.

Figur 2
Figur 2. Svar av asiatiska citrus psyllid (Diaphorina citri) vuxna flyktiga ämnen från växter citrusfrukter värd kontra Clean Air Control (A) eller flyktiga citrus kontra flyktiga citrus tillsammans släpptes med en motbjudande (dimetyldisulfid) (B) i ett vertikalt orienterat T -labyrint olfaktometer Figur 2A:. Enkel variansanalys (ANOVA) följt av Tukeys HSD-test (α <0,05) utfördes för att jämföra antalet psyllid göra ett val mellan antingen armen (2 behandlingar, n = 120). Kolonner som anges med olika bokstäver är signifikant olika från varandra (α <0,05) Figur 2B:. Enkel analysär av varians (ANOVA) följt av Tukeys HSD-test (α <0,05) utfördes för att jämföra antalet psyllid göra ett val mellan antingen arm eller kvar i släppunkt (3 behandlingar, n = 120). Kolonner som anges med olika bokstäver är signifikant olika från varandra (α <0,05).

Discussion

Häri är en analysanordning och protokoll beskrivs för att mäta responsen av små leddjur (Insecta: Hemiptera: Psyllidae) till luktämnen. Metoden innebär ett val test så insekten att göra ett val mellan två odorant fält i fråga om analyser utvärderar en förmodad lockmedel. Vidare kan testpersonen visar tre typer av beteenden genom att lämna frigöringsarmen och ange endera av två potentiella lukt fält, eller stanna kvar på frigöringsarmen, i fallet med repellerande analyser. Den olfaktometer möjliggör hög genomströmning datainsamling eftersom det tar fördel av den negativa geotactic (tendens att röra sig uppåt) och positiva phototactic (tendens att röra sig mot ljus) naturlig beteendegensvar många leddjur. Även om den nuvarande demonstrationen använder en psyllid exempel insekt test kan analysen lätt anpassas till leddjur brett, både de som använder flyg eller promenader som dominerande transportsätt.

12. De specifika mönster av sådana olfactometers varierar kraftigt, men beskrivs variationer på allmänna temat för två-valet analys här, liksom, liknande Y-rör analyser ofta har använts för att mäta leddjur svar på kemikalier. Större flyg tunnlar som kan orsaka långvariga flygningar av insekter 9 har också resulterat i insamlingen av banbrytande uppgifter klargöra de grundläggande mekanismerna för insekter flyg och orientering semiochemicals liksom, data informera praktisk användning av skadedjursbekämpning verktyg.

Det är ofta nödvändigt att skräddarsy designen en olfaktometer och tillhörande instrumentering för biologi specifika leddjur försöksperson. De olfactometers som kan användas bland en allmän grupp av insekter är mer användbara än de specIFIC till en liten grupp, men ibland den ekonomiska betydelsen av en liten grupp av insekter dikterar behovet av utveckling av en mycket specifik olfaktometer och analystekniken. Den för närvarande beskrivna konstruktionen bygger på tidigare kända artropoda tekniker. Det möjliggör en mer standard två-val-analys än Y-rör bioanalyser där den experimentella arenan eller val test tar formen av en Y-formad glas anordning 7. Typiskt kommer en arm av ett sådant Y-rör få en behandling luktämne, medan den andra kommer att lämnas tom 13. Variationer på sådana olfactometers kan omfatta tillägg av flera strålande armar 14 och till och med tillägg av en jord medium för att analysera beteendet hos organismer som rör sig genom marken 15. Att utveckla sådana olfactometers och tillhörande analyser, är det viktigt att tänka på hur nära naturliga förhållanden replikeras och därmed den verkliga betydelsen av de bedömda beteendemässiga svar i termer av testpersonerna "biologi. Till en laRGE examen kommer de insamlade uppgifterna endast så användbar som relevansen av den beteendemässiga biotest med avseende på organismens beteendeekologi 16.

Den för närvarande beskrivna olfaktometer och beteendemässiga bioanalys är särskilt utformad för en hemipteran insekt som tenderar att initiera flygning som korta "hopp" 16. Den vertikala orienteringen av olfaktometer och ljuskällan arrangemanget underlättar initiering av insekter rörelse och därmed efterföljande kemiskt medierad orientering beteende kan analyseras effektivt och med hög genomströmning. Detta beteende analys arrangemang kan sannolikt användas för ett brett spektrum av flygande eller gå leddjur taxa eller kan också lätt modifieras för att passa behovet av icke-leddjur organismer.

Disclosures

Författaren erhållit finansiering som tillhandahålls av Citrus forskning och utveckling Foundation.

Acknowledgments

Citrus Forskning och utveckling Stiftelsen är känd för att ge stöd. Tack vare Angel Hoyte och Michael Flores för ledning bioanalyser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Two port divided T-olfactometer Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL None(Custom made) If unavailable from ARS, Southern Scientific (Gainesville, FL) also currently builds and distributes such equipment.
Solid-phase micro-extraction holding/odor source chamber with Teflon;-glass tube connectors. Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL RV-R3 See above comment
Air delivery system Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL HADS-2AFM2C.4 See above comment
Guillotine chamber Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL L3GP3 See above comment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Resh, R. H., Cardé, R. T. Encyclopedia of Insects. Academic Press, Elsevier Science. USA. (2003).
  2. Biorational tree-fruit pest management. Aluja, M., Lesky, T. C., Vincent, C. CABI. USA. (2009).
  3. Rodriquez-Saona, C., Stelinski, L. L. Behavior-modifying strategies in IPM: Theory and Practice. Integrated Pest Management: Innovation - Development Process. Peshin, R., Dhawan, A. K. Springer. NY. 261-311 (2009).
  4. Cardé, R. T., Millar, J. G. Advances in insect chemical ecology. Cambridge University Press. UK. (2004).
  5. Knight, A. L., Stelinski, L. L., Hebert, V., Gut, L., Light, D., Brunner, J. Novel dispensers simultaneously releasing pear ester and sex pheromone for disruption of codling moth (Lepidoptera: Tortricidae). Journal of Applied Entomology. 136, (1-2), 79-86 (2012).
  6. Mann, R. S., Tiwari, S., Smoot, J. M., Rouseff, R. L., Stelinski, L. L. Repellency and toxicity of plant-based essential oils and their constituents against Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae). Journal of Applied Entomology. 136, (1-2), 87-96 (2012).
  7. Forbes, A. A., Powell, H. Q., Stelinski, L. L., Smith, J. J., Feder, J. L. Sequential sympatric speciation across trophic levels. Science. 323, (5915), 776-779 (2009).
  8. Kennedy, J. S. The visual responses of flying mosquitos. Proceedings of the Zoological Society of London A. 109, (4), 221-242 (1940).
  9. Miller, J. R., Roelofs, W. L. Sustained-flight tunnel for measuring insect responses to wind-borne sex pheromones. Journal of Chemical Ecology. 4, (2), 187-198 (1978).
  10. Mann, R. S., Rouseff, R. L., Smoot, J. M., Castle, W. S., Stelinski, L. L. Sulfur volatiles from Allium spp. affect Asian citrus psyllid, Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae), response to citrus volatiles. Bulletin of Entomological Research. 101, (1), 89-97 (2011).
  11. Onagbola, E. O., Rouseff, R. L., Smoot, J. M., Stelinski, L. L. Guava leaf volatiles and dimethyl disulfide inhibit response of Diaphorina citri Kuwayama to host plant volatiles. Journal of Applied Entomology. 135, (6), 404-414 (2011).
  12. Baker, T. C., Linn, C. E. Wind tunnels in pheromone research. Techniques in Pheromone Research. Hummel, H., Miller, T. A. Springer-Verlag. New York. 75-110 (1984).
  13. Stelinski, L. L., Rodriguez-Saona, C., Meyer, W. L. Recognition of foreign oviposition marking pheromone in a multitrophic context. Naturwissenschaften. 96, (5), 585-592 (2009).
  14. Gökçe, A., Stelinski, L. L., Whalon, M. E. Behavioral and electrophysiological responses of leafroller moths to selected plant extracts. Environmental Entomology. 34, (6), 1426-1432 (2005).
  15. Ali, J. G., Alborn, H. T., et al. herbivore-induced plant volatile increases biological control activity of multiple beneficial nematode species in distinct habitats. PLoS ONE. 7, (6), e38146 (2012).
  16. Mann, R. S., Ali, J. G., et al. Induced release of a plant defense volatile 'deceptively' attracts insect vectors to plants infected with a bacterial pathogen. PLoS Pathogens. 8, (3), e1002610 (2012).
Vertikal T-labyrint Val analys för Arthropod svar på luktämnen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stelinski, L., Tiwari, S. Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants. J. Vis. Exp. (72), e50229, doi:10.3791/50229 (2013).More

Stelinski, L., Tiwari, S. Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants. J. Vis. Exp. (72), e50229, doi:10.3791/50229 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter