एक साथ पूर्व और बाद synaptic electrophysiological रिकॉर्डिंग से<em> Xenopus</em> तंत्रिका पेशी सह संस्कृतियों

Summary

इस वीडियो में भ्रूण की प्राथमिक संस्कृतियों विकसित किया प्रक्रियाओं को दर्शाता<em> Xenopus</em> तंत्रिका और मांसपेशियों की कोशिकाओं और एक साथ पूर्व और बाद synaptic पैच दबाना रिकॉर्डिंग बनाने के लिए इस तैयारी की उपयोगिता.

Abstract

Presynaptic neurotransmitter की रिहाई के साथ ईओण धाराओं के युग्मन के बारे में ज्यादा जानकारी के invertebrate की तैयारी, सबसे विशेष रूप से विद्रूप विशाल synapse ¹ से प्राप्त किया गया है. हालांकि, तैयार करने के लिए छोड़कर यहाँ वर्णित है, कुछ हड्डीवाला की तैयारी मौजूद हैं जो यह संभव है neurotransmitter रिहाई और presynaptic ईओण धाराओं के युगपत माप. भ्रूण Xenopus motoneurons और मांसपेशियों की कोशिकाओं सरल संस्कृति के माध्यम में एक साथ हो सकते हैं और कमरे के तापमान पर, वे बारह चौबीस घंटे के भीतर कार्यात्मक synapses रूप, और कई दिनों के लिए तंत्रिका और मांसपेशी कोशिका विकास और synaptic बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (जब तक अतिवृद्धि) होता है. इन अन्य हड्डीवाला तैयारियाँ पर सह संस्कृतियों के कुछ फायदे तैयारी की सादगी, संस्कृतियों और कमरे के तापमान पर काम करने के लिए बनाए रखने की क्षमता है, और synapses के तैयार पहुंच ² का गठन-4. तैयारी व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है presynaptic आयन चैनल और ट्रांसमीटर ^5-8 रिलीज के विनियमन के biophysical गुणों का अध्ययन. इसके अलावा, तैयारी ही neurite परिणाम और synaptogenesis के अध्ययन ^9-12, neurotransmitter रिहाई ^{13-15, 16,17} neuromodulation में diffusible दूतों की भूमिका के आणविक तंत्र, और इन विट्रो synaptic plasticity ¹⁸ में सहित अन्य का उपयोग करता है के लिए व्रत है ^{– 19.}

Protocol

1. पूर्व प्रयोगात्मक तैयारी निम्नलिखित (रचनाओं के लिए 1 टेबल देखें) समाधान तैयार: (क) 1 लीटर (सामान्य मेंढक घंटी) NFR, (ख) 100 मिलीलीटर 10% खारा, (ग) 100 मिलीलीटर सीएमएफ (2 Ca + / 2 मिलीग्राम समाधान +-मुक्त ), (घ) 1 मिलीग्राम इसके (इंसुलिन transferrin सेलेनियम, I1884 सिग्मा), (ई) 100 मिलीलीटर एल-15 मध्यम संस्कृति, (च) 10 मिलीलीटर एचसीजी (मानव chorionic gonadotropin तटरक्षक-10 सिग्मा), (छ) 100 मिलीलीटर कश्मीर समाधान amphotericin बी के लिए आंतरिक, (ज) 100 मिलीलीटर कश्मीर समाधान +-1 समाधान के आसमाटिक ताकत आंतरिक करने के लिए सुनिश्चित करें कि यह एक वाष्प दबाव osmometer (जैसे Wescor मॉडल 5100C #) का उपयोग लगभग 260 mOsM जाँच की जानी चाहिए . समाधान बाँझ बनाना फ़िल्टर (ख) और (ग). समाधान (क) (ख) और (ग) तीन महीने के लिए कर सकते हैं 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत Lyophilized पाउडर युक्त शीशी एक 25 गेज सिरिंज सुई और सिरिंज फिल्टर के माध्यम से 1 मिलीलीटर विआयनीकृत एच 2 हे जोड़कर तैयार समाधान (घ). यह अंतिम समाधान ग4 डिग्री सेल्सियस पर 30 दिनों के लिए भंडारित किया. एक लामिना का प्रवाह हुड में एक बीकर या कुप्पी में सभी घटकों के संयोजन द्वारा तैयार समाधान (ई). फ़िल्टर अंतिम समाधान बाँझ बनाना और बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूबों में 10 मिलीलीटर aliquots हस्तांतरण. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर Lyophilized पाउडर युक्त एक 25 गेज सिरिंज सुई और सिरिंज फिल्टर के माध्यम से शीशी 10 2 0 एच विआयनीकृत मिलीलीटर जोड़कर एचसीजी ((च) समाधान) तैयार करें. यह अंतिम समाधान के 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 दिनों के लिए भंडारित किया जा सकता है. Cyanoacrylate गोंद के साथ एक गिलास पाश्चर विंदुक के अंत के लिए एक Minutien पिन (26002-10, ललित विज्ञान उपकरण) gluing द्वारा कम से कम दो microdissection उपकरण बनाना. पिन के तेज अंत विंदुक के अंत अतीत लगभग 0.5 सेमी का विस्तार करने की अनुमति दें. संस्कृतियों की तैयारी दो दिन पहले, निम्न प्रक्रिया के साथ प्रजनन प्रेरित. महिला और अंधेरे pigmentation पर planar सु पर एक प्रमुख, लाल क्लोअका देख Xenopus प्रजनन के लिए तैयार की एक जोड़ी को पहचानेंपुरुष के सामने पंजे के rface. एक समय, शुद्ध प्रत्येक मेंढक और एक उदर पक्ष पकड़ नीचे एक सिंक पर शुद्ध के साथ इतना है कि यह नहीं बच सकते हैं. पृष्ठीय लिम्फ थैलियों के शुद्ध और subcutaneously में एक के माध्यम से समाधान के 1 मिलीलीटर (च) सुई. एक कवर दस गैलन पानी की टंकी में प्रजनन जोड़ी एक साथ रखें. यह सुनिश्चित करना है कि जानवरों के नए रखी और निषेचित अंडे नहीं रौंद होगा, लगभग एक जाल आकार ½ "सज्जित की टंकी के नीचे (चित्रा 1 ए) के ऊपर लगभग 1-2 इंच के साथ एक जांच फर्श स्थापित. 12-48 घंटे के लिए undisturbed मेंढ़कों छोड़ दें जब तक जानवरों amplexus में हैं और निषेचित अंडे (चित्रा 1B) स्क्रीन के नीचे फर्श पर मनाया जाता है. टैंक से पशुओं निकालें, लेकिन अंडे कम से कम 24 घंटे के लिए अब तक अछूता छोड़ दें. मेंढ़क की यह जोड़ी छह हफ्तों के बाद किया जा सकता है फिर से पैदा की. टंकी के नीचे से भ्रूण ढीला और उन्हें चार या पांच 60×15 मिमी पंथ हस्तांतरणure 10% खारा (समाधान ख) युक्त व्यंजन. मंच द्वारा भ्रूण Niewkoop एंड फैबर (20 Ref.) की योजना के अनुसार सॉर्ट. उपयोगी भ्रूण 22-24 चरण में उन चित्रा 2A लगभग 22 चरण में एक भ्रूण से पता चलता है, जबकि चित्रा 2B एक भ्रूण है कि बहुत दूर है विकास में साथ उपयोगी हो सकता है (लगभग 28 चरण) से पता चलता है. जाएगा. यह महत्वपूर्ण है कि भ्रूण कि स्वस्थ हैं का चयन: जो कि हल्के भूरे और सफेद mottling के साथ उपस्थिति में आसानी से कर रहे हैं आदर्श हैं. भ्रूण कि बड़े काले या सफेद धब्बे आम तौर पर अस्वस्थ हैं और व्यर्थ है. 2. Xenopus भ्रूण की Microdissection अंदर एक लामिना का प्रवाह हुड लेबल, और 10% नमक के साथ आधे रास्ते में लगभग तीन 60×15 मिमी बाँझ संस्कृति व्यंजन को भरने, और एक सीएमएफ के साथ. 10% खारा युक्त व्यंजनों की एक में एक बाँझ, कांच पाश्चर विंदुक हस्तांतरण पांच से दस चरण 22-24 भ्रूण का उपयोग. एक स्टीरियो ज़ूम के टुकड़े करना सहायता के साथहुड अंदर आईएनजी माइक्रोस्कोप (10 x eyepieces के साथ 0.6 5x), प्रत्येक बाँझ संदंश # 5 (11251-30, ललित विज्ञान उपकरण) के दो जोड़े का उपयोग भ्रूण से जेली कोट और पीतक झिल्ली को हटा दें. (आंकड़े 3A और 3B देखें.) उन्हें गुजर रहा है, 10% खारा के शेष दो व्यंजन के माध्यम से और अंत में सीएमएफ युक्त डिश में एक समय में एक, नंगे भ्रूण धो लें. प्रत्येक हस्तांतरण के लिए एक नई, बाँझ विंदुक का प्रयोग करें और पकवान से पकवान के लिए हस्तांतरित समाधान की मात्रा कम से कम. बदले में, प्रत्येक भ्रूण धीरे लेकिन दृढ़ता और संदंश की एक जोड़ी के साथ पकड़, microdissection 1.5 चरण में फैशन उपकरण का उपयोग कर, न्यूरल ट्यूब और जुड़े myotomes जो पशु का सबसे पृष्ठीय पहलू में स्थित हैं हटा दें. तीन स्लाइस, एक न्यूरल ट्यूब के स्थान और एक तिहाई सिर्फ यह (4A चित्रा) उदर के दोनों छोर पर बना यह मत करो. पकवान की एक साफ हिस्सा प्रत्येक dissected न्यूरल ट्यूब / myotome जर्दी granul से दूर हटोतों और अन्य मलबे (4B चित्रा). अक्ष पृष्ठीय उदर और तंत्रिका ट्यूब और myotomes के स्थानों चित्रा 4 में संकेत कर रहे हैं. इस समाधान के बारे में पन्द्रह मिनट के बाद (सीएमएफ) का उपयोग करने के लिए pigmented dissected ऊतक से मुक्त त्वचा उठा और त्यागें संदंश. एक अतिरिक्त 30-60 मिनट के बाद, कोशिकाओं एक "रेत ढेर" फार्म के रूप में वे एक दूसरे (चित्रा 4C) से अलग हो जाएगा. 3. तंत्रिका पेशी सह संस्कृतियों की तैयारी एक संस्कृति के माध्यम के 10 मिलीलीटर ट्यूब पिघलना और aseptically 70 μl जोड़ने और 35 एनजी / एमएल BDNF (B3795 सिग्मा). लेबल और बाँझ 35 मिमी संस्कृति व्यंजन (FD35-100 विश्व प्रेसिजन उपकरण) एल 15-संस्कृति मध्यम (समाधान (ई)), एक प्रत्येक dissected भ्रूण के लिए साथ लगभग आधे रास्ते भर. एक गिलास पाश्चर विंदुक के प्रत्येक के अंत लोभी, जबकि एक लौ से अधिक पतला भाग पकड़ द्वारा एक चढ़ाना विंदुक बनाना. समाप्त होता है के बारे में 1 के अलावा खींचो0 सेमी और फिर अंत तोड़ने के लिए लगभग 0.2 मिमी की एक टिप उपज. चढ़ाना विंदुक का प्रयोग करने के लिए तैयार समाधान की राशि कम से कम एक भ्रूण से "रेत ढेर 'चूसना. एक संस्कृति डिश के तल पर कोशिकाओं निष्कासित. कई लाइनों में कोशिकाओं प्लेट. मढ़वाया undifferentiated कोशिकाओं (चित्रा 5A और 5 ब) को ध्यान से देखें. मढ़वाया कोशिकाओं के व्यंजन कम से कम पंद्रह मिनट के लिए undisturbed छोड़ कोशिकाओं समय डिश के लिए अनुमति देते हैं. 4. पैच Clamping तंत्रिका पेशी Synapses मांसपेशियों की कोशिकाओं तकुए के आकार का हो गया है और रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स लंबी प्रक्रियाओं (6 चित्रा) का विस्तार: संस्कृति में 12-24 घंटे के बाद, मढ़वाया कोशिकाओं विशिष्ट morphological विशेषताओं पर ले. Neurite varicosities और मांसपेशियों की कोशिकाओं के बीच कार्यात्मक synaptic संपर्क युगपत बनती electrophysiological रिकॉर्डिंग के साथ पुष्टि की जा सकती है. "एम", "एस" और "वी" मांसपेशी कोशिका का उल्लेख है, क्रमशः neuronalसोम और presynaptic अपस्फीति. Presynaptic अपस्फीति के लिए एक और मांसपेशी कोशिका के लिए: दो रिकॉर्डिंग के लिए पैच इलेक्ट्रोड तैयार. प्रीसानेप्टिक इलेक्ट्रोड के लिए, के रूप में amphotericin युक्त एक समाधान तैयार: एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge 5 मिलीग्राम amphotericin बी (A4888 सिग्मा) युक्त ट्यूब 100 μl DMSO जोड़ें. भंवर 10 सेकंड के लिए इस समाधान. अगले, एक 2 microcentrifuge ट्यूब है कि amphotericin बी ((ज) समाधान) के लिए 625 μl +-आंतरिक समाधान K शामिल करने के लिए इस समाधान के 10 μl जोड़ने. इसके बाद के संस्करण के रूप में भंवर. Amphotericin युक्त +-आंतरिक 4.3 चरण में तैयार समाधान कश्मीर और कश्मीर समाधान + आंतरिक ((छ) समाधान) के साथ बाद synaptic इलेक्ट्रोड के साथ इलेक्ट्रोड पूर्व synaptic भरें. NFR साथ संस्कृति डिश में मीडिया की जगह है और यह एक औंधा चरण विपरीत प्रकाशिकी के साथ लगे माइक्रोस्कोप स्थानांतरित. उनके संबंधित लक्ष्य को बस के ऊपर दोनों इलेक्ट्रोड स्थिति. पूरे सेल सह प्राप्तअपस्फीति इलेक्ट्रोड के साथ छिद्रित पैच विन्यास पहले मांसपेशी कोशिका इलेक्ट्रोड के साथ nfiguration. Synapse की कार्यक्षमता की पुष्टि करने के लिए, एक पैच दबाना एम्पलीफायर के साथ अपस्फीति चुम्बकत्व से वंचित करना (जैसे Axopatch 200B, आणविक उपकरणों) सॉफ्टवेयर नियंत्रण के तहत (9 pCLAMP, आणविक उपकरणों द्वारा उदाहरण के लिए) और निरीक्षण युगपत presynaptic और postsynaptic धाराओं 7 चित्रा देखा धाराओं से पता चलता है. वोल्टेज के कदम 10 -30 mV से 40 एमवी mV वेतन वृद्धि में presynaptic अपस्फीति दिया depolarizing के जवाब में. आवक प्रीसानेप्टिक सेल में देखा धाराओं ना + और ​​2 Ca + और ​​कश्मीर + द्वारा जावक धाराओं के द्वारा किया जाता है. पोस्टअन्तर्ग्रथनी कक्ष में दर्ज धाराओं अपस्फीति से जारी neurotransmitter प्रतिक्रिया कर रहे हैं और ना + द्वारा ज्यादातर निकोटिनिक acetylcholine रिसेप्टर चैनलों के माध्यम से किया जाता है.

Representative Results

चित्रा 4B 22 Xenopus भ्रूण 4C चित्रा से पता चलता है कि (2 Ca + मिलीग्राम 2 +-मुक्त समाधान में त्वचा को हटाने और ऊष्मायन (सीएमएफ, समाधान के बाद एक मंच से हटाने के तुरंत बाद एक पृथक / कॉर्ड myotome रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय दृश्य दिखाता ग)), कोशिकाओं एक "रेत ढेर" में अलग कर देना और चढ़ाना के लिए तैयार कर रहे हैं. तुरंत बाद संस्कृति के माध्यम कोशिकाओं में चढ़ाना प्रदर्शन थोड़ा morphological परिवर्तनशीलता (चित्रा 5 ब) लेकिन संस्कृति में चौबीस घंटे के बाद अलग आकार पर ले. मांसपेशियों की कोशिकाओं तकुए के आकार का हो गया है, जबकि न्यूरॉन्स का विस्तार neurites whilst गोलाकार रहते हैं कि मांसपेशियों की कोशिकाओं के साथ synapses (6 चित्रा) में विस्तृत varicosites. युगपत बनती presynaptic अपस्फीति और postsynaptic मांसपेशी कोशिका (7 चित्रा) से पैच रिकॉर्डिंग presynaptic आवक और जावक neurotransmitter की रिहाई और resulta के साथ जुड़े धाराओं का पता चलता हैNT के उत्तेजक postsynaptic धाराओं. चित्रा 1: एक. स्क्रीन के ऊपर संभोग बाल्टी में मेंढकों की प्रजनन जोड़ी बी: amplexus में निषेचित अंडे के साथ मेंढक. चित्रा 2 एक:. "उपयुक्त" चरण 22 भ्रूण बी: "अनुपयुक्त" 28 भ्रूण चरण. स्केल बार 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है. चित्रा 3: स्टेज 22 भ्रूण पीतक झिल्ली और जेली कोट के हटाने से पहले. तीर जेली कोट के बाहरी छोर के लिए अंक है. पीतक झिल्ली embr को बारीकी से पालन करता हैयो और लगभग अदृश्य है बी: नंगे भ्रूण. स्केल बार 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है. चित्रा 4: स्टेज एक धराशायी हो dissected भाग बी का संकेत लाइन के साथ 22 भ्रूण:. तीव्रता पृथक भ्रूण के पृष्ठीय भाग, 'डी' और 'वी' भ्रूण के पृष्ठीय और उदर पहलुओं को देखें, जबकि "मी" और mytomes और न्यूरल ट्यूब की अनुमानित स्थानों n "" इंगित सी: सीएमएफ में 60 मिनट के बाद कोशिकाओं की रेत ढेर ". स्केल बार एक के लिए 1 मिमी, और बी और सी के लिए 0.5 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है. चित्रा 5: संस्कृति में चढ़ाना के बाद तुरंत कोशिकाओं के 5x शक्ति दृश्य. बी: 40x पर समान संस्कृति. स्केलबार के लिए एक 40 सुक्ष्ममापी, और बी के लिए 5 सुक्ष्ममापी का प्रतिनिधित्व करता है चित्रा 6 neuronal सोम (एस), presynaptic अपस्फीति (वी), और postsynaptic मांसपेशी कोशिका (एम) की पहचान के साथ संस्कृति में neuromuscular जंक्शन. स्केल पट्टी: 5 सुक्ष्ममापी. 7 चित्रा (ऊपर) presynaptic और postsynaptic (नीचे) 10 mV वृद्धिशील वोल्टेज के आवेदन के जवाब में देखा धाराओं -30 mV से 40 एमवी presynaptic अपस्फीति प्रस्तुत पर कदम. वोल्ट presynaptic निशान के कुछ करने के लिए अगले कदम संकेत कर रहे हैं. दोनों कक्षों के लिए धारण की क्षमता -70 mV था.

Discussion

सफल motoneurons और मांसपेशियों की कोशिकाओं के सह संवर्धन में महत्वपूर्ण कदम उचित Xenopus मेंढ़कों प्रेरित प्रजनन से उत्पादित भ्रूण का मंचन किया का उपयोग करते हैं, और undifferentiated रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स और myoblasts सावधान सड़न रोकनेवाला विच्छेदन हैं. निषेचित अंडे undisturbed छोड़ दिया जाना चाहिए जब तक वे लगभग 10 अवस्था तक पहुंचने या तो उन्हें जल्दी ही अक्सर जा स्टापें उनके विकास. स्वस्थ भ्रूण एक चिकनी उपस्थिति और एक भूरे और सफेद धोब्बेदार रंग की पहचान कर रहे हैं. स्टेज 22-24 भ्रूण सबसे उपयोगी हैं क्योंकि यह सिर्फ न्यूरल ट्यूब बंद कर देता है के बाद और इससे पहले myocytes काफी विभेदित किया है विकास के दौरान बिंदु है. इसके अलावा, पुराने भ्रूण से कोशिकाओं सीएमएफ में अच्छी तरह से अलग कर देना करने में विफल है. देखभाल जब पीतक झिल्ली को हटाने के रूप में यह भ्रूण के लिए दृढ़ता से पालन करता है लिया जाना चाहिए. झिल्ली अलग फाड़ा तेज संदंश का उपयोग किया जाना चाहिए इतना है कि भ्रूण बरकरार उभर. एक अन्य महत्वपूर्ण precaution संस्कृति डिश (दे उन्हें वहाँ बसने के बजाय) के नीचे पर ध्यान कोशिकाओं जगह है. इस विधि के रूप में यह संभावना है कि कोशिकाओं संस्कृति डिश का पालन करना होगा बढ़ पसंद है.

तंत्रिका और मांसपेशियों के बीच कार्यात्मक neurotransmission सिर्फ postsynaptic रिकॉर्डिंग के साथ निर्धारित किया जा सकता है और अक्सर innervation के बाद सहज मांसपेशी संकुचन के अवलोकन से पता लगाया जा सकता है. अन innervated की मांसपेशी कोशिकाओं संस्कृति में नहीं चिकोटी. अकेले postsynaptic रिकॉर्डिंग लघु endplate धाराओं या क्षमता लेकिन पैदा की रिहाई के मापन presynaptic उत्तेजना, और पूर्व और postsynaptic धाराओं के सहसंबंध पैच – दबाना डबल की आवश्यकता की आवश्यकता है रिकॉर्डिंग के लिए उपयोगी है.

बनती पैच रिकॉर्डिंग यहाँ वर्णित विधि के अलावा, इस तैयारी neuronal ⁵ सोम से कम एक तिहाई विंदुक में पेश करने का अवसर प्रदान करता है, यह अनुमति देता है एक कार्रवाई संभावित था की पीढ़ीpresynaptic अपस्फीति के लिए प्रचार और neurotransmitter की रिहाई के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसके अलावा, ख्यात एजेंटों कि मध्यस्थता करने के लिए लगा रहे हैं या synaptic प्रसारण व्यवस्थित synapse के दोनों ओर से शुरू किया जा सकता है: मांसपेशी कोशिका विंदुक के माध्यम या एक तिहाई सोमा में रखा विंदुक से प्रसार के माध्यम से.

Materials

Equipment/Supplies	Vendor	Catalogue/Model Number
Insulin-Transferrin-Selenium	Sigma	I1884
Human Chorionic Gonadotropin	Sigma	CG-10
Vapor Pressure Osmometer	Wescor	5100C
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Amphotericin B	Sigma	A4888
Forceps	Fine Science Tools	11251-30
			Solution Name Recipe (a) NFR (Normal Frog Ringer (in mM) 116 NaCl, 2 KCl, 1.8 CaCl2, 5 Na+-HEPES, pH 7.35. (b) 10% saline 10 ml NFR+90 ml deionized H2O (c) CMF (Ca2+ /Mg2+-free solution) 125 NaCl, 2 KCl, 1.2 EDTA, 5 Na+-HEPES, pH 7.35. (e) L-15 Culture Media 50 ml L-15 media (Sigma L1518) + 50 ml NFR. (g) K+-internal solution (in mM) 116 KCl, 1 NaCl, 1 MgCl2, 10 EGTA, 5 HEPES, pH 7.3 (h) K+-internal solution for Amphotericin B (in mM) 52 K2SO4, 38 KCl, 1 EGTA, 5 HEPES, pH 7.3

Table 1.