Summary
Deze video toont de procedures die worden gebruikt om primaire culturen van embryonale groeien
Abstract
Veel informatie over de koppeling van presynaptische ionenstromen met de release van neurotransmitter is verkregen van ongewervelde voorbereidingen, met name de inktvis gigantische synaps 1. Met uitzondering van het preparaat beschreven, enkele vertebrate preparaten bestaan waarin het mogelijk is om gelijktijdige metingen van neurotransmitters en presynaptische ionenstromen. Xenopus embryo motoneuronen en spiercellen kunnen worden gekweekt samen eenvoudige kweekmedium bij kamertemperatuur ze functionele synapsen vormen in twaalf tot vierentwintig uur, en kan worden gebruikt voor zenuwen en spieren cel ontwikkeling en synaptische interacties bestuderen enkele dagen (tot overgroei optreedt). Enkele voordelen van deze co-culturen over andere gewervelde preparaten omvatten de eenvoud van bereiding, de mogelijkheid om de culturen en werk bij kamertemperatuur behouden en de toegankelijkheid van de gereed gevormde synapsen 2-4. De voorbereiding is op grote schaal gebruikt om de biofysische eigenschappen van presynaptische ionenkanalen en de regulering van afgifte van transmitter vijf-acht bestuderen. Bovendien heeft het preparaat gegeven tot andere toepassingen waaronder de studie van neurietuitgroei en synaptogenese 9-12, moleculaire mechanismen van neurotransmitters 13-15, de rol van diffundeerbare boodschappers in neuromodulatie 16,17 en in vitro synaptische plasticiteit 18 - 19.
Protocol
1. Pre-experimentele Voorbereiding
- Bereid de volgende oplossingen (zie tabel 1 voor samenstelling): (a) 1 liter NFR (Normal Frog Ringer), (b) 100 ml 10% zoutoplossing, (c) 100 ml CMF (Ca2 + / Mg2 +-vrije oplossing ), (d) 1 ml ITS (Insulin-transferrine-Selenium, Sigma I1884), (e) 100 ml L-15 kweekmedium, (f) 10 ml HCG (humaan choriongonadotrofine Sigma CG-10), (g) 100 ml K +-interne oplossing, (h) 100 ml K +-interne oplossing voor amfotericine B. De osmotische sterkte van oplossing 1 worden gecontroleerd of het ongeveer 260 mOsM met een dampdrukosmometer (bijv. Wescor model # 5100C) .
- Filter steriliseer oplossingen (b) en (c). Solutions (a) (b) en (c) worden opgeslagen tot drie maanden bij 4 ° C. Maak een oplossing (d) door het toevoegen van 1 ml gedeïoniseerd H 2 O aan de injectieflacon met het gevriesdroogde poeder via een 25 gauge naald en spuit filter. Deze laatste oplossing cEen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 30 dagen.
- Pesticide (e) in een laminaire stroming kap door het combineren van alle componenten in een beker of fles. Filter steriliseren de uiteindelijke oplossing en breng 10 ml porties in steriele centrifugebuizen. Bewaren bij -20 ° C.
- Bereid de HCG (oplossing (f)) door het toevoegen van 10 ml gedeïoniseerd H 2 0 aan de injectieflacon met het gevriesdroogde poeder via een 25 gauge naald en spuit filter. Deze laatste oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C gedurende 30 dagen.
- Fabriceren tenminste twee microdissectie instrumenten door lijmen Minutien een pin (26.002-10, Fine Science Tools) aan het einde van een glazen Pasteur pipet met cyanoacrylaatlijm. Laat de scherpe uiteinde van de pen te verlengen voorbij het einde van de pipet ongeveer 0,5 cm.
- Twee dagen voor het bereiden van culturen, te induceren fokken met de volgende procedure. Identificeer een fokkerij-ready paar Xenopus door het observeren van een prominente, roodachtige cloaca op de vrouwelijke en donkere pigment op de vlakke surface van de voorpoten van het mannetje. Een voor een, netto elke kikker en houd deze ventrale zijde naar beneden op een spoelbak met het net, zodat het niet kan ontsnappen. Injecteer 1 ml van oplossing (f) via het net en subcutaan in een van de dorsale lymfe zakken.
- Leg de kweekkoppel in een overdekte tien liter tank van het water. Om ervoor te zorgen dat de dieren niet zal de nieuwe afgezet en bevrucht eieren vertrappen, installeert u een afgeschermde verdieping met een maaswijdte van ongeveer ½ "uitgerust ongeveer 1-2 cm boven de bodem van de tank (Figuur 1A).
- Laat kikkers ongestoord 12 tot 48 uur tot de dieren in Amplexus en bevruchte eicellen worden waargenomen op de vloer onder het scherm (Figuur 1B).
- Verwijder de dieren uit de tank, maar laat de eieren ongestoord gedurende ten minste 24 uur langer. Dit paar kikkers opnieuw kunnen worden gekweekt na zes weken.
- Maak de embryo's van de bodem van de tank en breng ze over naar vier of vijf 60x15 mm cultusure platen met 10% zoutoplossing (oplossing B). Sorteer de embryo's door fase volgens het schema van Niewkoop en Faber (ref. 20). Nuttige embryo's zijn die in stap 22-24. Figuur 2A toont een embryo in fase ongeveer 22 terwijl Figuur 2B toont een embryo dat te ver gevorderd in ontwikkeling bruikbaar (ongeveer stadium 28). Het is belangrijk om te kiezen embryo's die gezond zijn: die zijn glad in het uiterlijk met licht bruin en wit gespikkeld zijn ideaal. Embryo's die grote zwarte of witte vlekken hebben, zijn over het algemeen ongezond en onbruikbaar.
2. Microdissectie van Xenopus embryo
- Binnen een laminaire stroming kap, label en vul ongeveer halverwege drie 60x15 mm steriele cultuur gerechten met 10% zoutoplossing, en een met CMF.
- Een steriel glazen Pasteur pipet overdracht vijf tot tien stage 22-24 embryo's in een van de platen met 10% zoutoplossing. Met behulp van een stereo zoom ontledening microscoop in de kap (0,6-5x met 10 x oculairs), verwijder de gelei vacht en vitelline membraan van elk embryo gebruik van twee paar steriele # 5 pincet (11251-30, Fine Science Tools). (Zie Figuren 3A en 3B).
- Was de naakte embryo door ze, een voor een, door de resterende twee schalen van 10% zoutoplossing en uiteindelijk in het schaaltje met CMF. Gebruik een nieuwe, steriele pipet voor elke overdracht en het minimaliseren van het volume van de oplossing overgebracht van gerecht naar gerecht.
- Beurt elk embryo voorzichtig maar stevig vast met een pincet en met de microdissectie gereedschap gevormd in stap 1.5, verwijder de neurale buis en bijbehorende myotomes die zich aan de dorsale zijde van het dier. Doen door drie plakken, aan elke kant van de locatie van de neurale buis en een derde alleen ventraal (figuur 4A). Zet alle ontleed neurale buis / myotoom een schoon deel van de plaat weg van de dooier granules en ander afval (Figuur 4B). De dorsale-ventrale as en de locaties van de neurale buis en myotomes zijn in figuur 4.
- Na ongeveer vijftien minuten in deze oplossing (CMF) gebruik een tang om de gepigmenteerde huid vrij van de ontleed weefsel op te heffen en gooi deze weg. Na nog eens 30-60 minuten, zullen de cellen vormen een "sand pile" als ze los van elkaar (Figuur 4C).
3. Voorbereiding van zenuw-spier Co-culturen
- Ontdooi een 10 ml buis van kweekmedium, waarna aseptisch 70 ul ITS en 35 ng / ml BDNF (Sigma B3795).
- Label en vul steriele 35 mm kweekschalen (FD35-100 Wereld precisie-instrumenten) ongeveer halverwege met L-15 kweekmedium (oplossing (e)), een voor ontleed elk embryo.
- Fabriceren een plating pipet grijpen elk uiteinde van een glazen Pasteur pipet terwijl het tapse gedeelte boven een vlam. Trek de uiteinden elkaar tot ongeveer 10 cm en dan afbreken het einde om een fooi van ongeveer 0,2 mm te verkrijgen.
- Gebruik de pipet plating te zuigen de "zandhoop" van een embryo minimaliseren van de hoeveelheid oplossing getrokken. Uitzetting van de cellen op de bodem van een kweekschaal. Plaat de cellen in verschillende lijnen. Let plated ongedifferentieerde cellen (figuur 5A en 5B).
- Laat de gerechten van geplateerde cellen ongestoord gedurende ten minste vijftien minuten zodat de cellen de tijd te hechten aan het gerecht.
4. Patch Clamping zenuw-spier Synapsen
- Na 12-24 uur in cultuur geplateerde cellen nemen op verschillende morfologische kenmerken: spiercellen worden spoelvormige en spinale neuronen verbreed lange processen (Figuur 6). Functionele synaptische contact tussen neurieten varicosities en spiercellen kan worden bevestigd met gelijktijdige gekoppeld elektrofysiologische opnames. "M", "S" en "V" verwijzen respectievelijk naar de spiercel, neuronalesoma en presynaptische varicosity.
- Bereid twee patch-elektroden voor opname: een voor de presynaptische varicosity en een voor de spiercel.
- Voor de presynaptische elektrode, een voor amfotericine bevattende oplossing als volgt: voeg 100 ul DMSO tot een 1,5 ml microcentrifuge buis die 5 mg amfotericine B (Sigma A4888). Vortex deze oplossing gedurende 10 sec. Voeg vervolgens 10 pl van deze oplossing een tweede microcentrifugebuis die met 625 pi K +-interne oplossing voor amfotericine B (oplossing (h)) bevat. Vortex zoals hierboven.
- Vul de presynaptische elektrode met het amfotericine bevattende K +-interne bereid in stap 4.3 en het postsynaptische elektrode met K +-internal (oplossing (g)).
- Vervang media in de cultuur schotel met NFR en het weer in een omgekeerde microscoop uitgerust met fasecontrast optiek.
- Plaats beide elektroden net boven hun respectievelijke doelstellingen. Het verkrijgen van de whole-cell configuration de spiercellen elektrode voordat de geperforeerde patch configuratie met varicosity elektrode.
- Om de functionaliteit van de synaps te bevestigen, depolariseren de varicosity met een patch-clamp-versterker (bijv. Axopatch 200B, Molecular Devices) onder software controle (bijvoorbeeld door pCLAMP 9, Molecular Devices) en observeer de gelijktijdige presynaptische en postsynaptische stromingen. Figuur 7 toont gezien de stromingen in reactie op depolariserende stappen van spanning aan de presynaptische varicosity in 10 mV stappen van -30 mV tot +40 mV. De actieve stromen gezien in de presynaptische cel worden gedragen door Na + en Ca2 + en de uiterlijke stromen door K +. Stromingen opgenomen in de postsynaptische cel zijn reacties op neurotransmitter vrij uit de varicosity en meestal door Na + door middel van nicotine acetylcholine receptor kanalen.
Representative Results
Figuur 4B toont de dorsaal aanzicht van een geïsoleerd ruggenmerg / myotoom direct na het verwijderen van een stadium 22 Xenopus embryo. Figuur 4C toont dat na verwijdering en huid incubatie in Ca 2 +-Mg2 +-vrije oplossing (CMF, oplossing ( c)), cellen dissociëren in een "zandhoop" en zijn klaar voor plating. Onmiddellijk na plating in kweekmedium cellen vertonen weinig morfologische variabiliteit (Figuur 5B), maar nemen verschillende vormen na vierentwintig uur in cultuur. Spiercellen worden spoelvormige terwijl neuronen blijven terwijl sferische zich neurieten die uitgebreide varicosites bij synapsen met spiercellen (Figuur 6). Gelijktijdig gepaarde patch opname van de presynaptische en postsynaptische varicosity spiercel (Figuur 7) onthult de presynaptische binnen en naar buiten stromen in verband met het vrijkomen van neurotransmitter en de resultant prikkelend postsynaptische stromingen.
Figuur 1 A:.. Fokken paar kikkers in het koppelen emmer bovenop het scherm B: Kikkers in Amplexus met bevruchte eieren.
Figuur 2 A:.. "Geschikt" stage 22 embryo B: "niet geschikt" stadium 28 embryo. Schaal balk vertegenwoordigt 1 mm.
Figuur 3 A:. Fase 22 embryo vóór verwijdering van vitelline membraan en gelei vacht. De pijl wijst naar de buitenrand van de gelei vacht. De vitelline membraan hecht goed naar de embryo en is vrijwel onzichtbaar B:. Bare embryo. Schaal balk vertegenwoordigt 1 mm.
Figuur 4 A: Stage 22 embryo met een stippellijn aangegeven te worden ontleed deel B:.. Acuut geïsoleerd dorsale gedeelte van embryo; "d" en "v" verwijzen naar de dorsale en ventrale aspecten van de embryo's, terwijl "m" en "n" geeft de geschatte locatie van de neurale buis en mytomes C:. "Sand pile" cellen na 60 min in CMF. Schaalbalk is 1 mm voor A en 0,5 mm voor B en C.
Figuur 5 A:. 5x vermogen gezien in kweek onmiddellijk na plateren. B: Zelfde cultuur bij 40x. Schaalbar vertegenwoordigt 40 urn voor A en 5 urn voor B.
Figuur 6. Neuromusculaire junctie in cultuur identificatie van neuronale soma (S), presynaptische varicosity (V), en postsynaptische spiercellen (M). Schaalmaat: 5 pm.
Figuur 7. Presynaptische (boven) en postsynaptische (onder) stromen waargenomen in reactie op verzoek van 10 mV incrementele spanningsverschillen aan de presynaptische varicosity van -30 mV tot +40 mV. Spanningsverschillen naast enkele presynaptisch sporen aangegeven. De holding potentieel voor beide cellen was -70 mV.
Discussion
Cruciale stappen in de succesvolle co-kweken van motorneuronen en spiercellen zijn het gebruik van passende gefaseerde embryo's die uit de geïnduceerde kweken van Xenopus kikkers en de zorgvuldige aseptische dissectie van de ongedifferentieerde spinale neuronen en myoblasten. Bevruchte eieren moeten worden met rust gelaten totdat ze ongeveer stadium 10 of zo als het verplaatsen van hen vroeg vaak stopt hun ontwikkeling. Gezonde embryo's zijn te herkennen aan een glad uiterlijk en een bruine en witte gevlekte kleuren. Stage 22-24 embryo het meest nuttig omdat dit het punt tijdens ontwikkeling vlak na de neurale buis gesloten en voor de myocyten aanzienlijk zijn gedifferentieerd. Daarnaast cellen van oudere embryo's niet goed dissociëren in CMF. Voorzichtigheid is geboden bij het verwijderen van de vitelline membraan als het een sterke hechting op het embryo. Het membraan moet uit elkaar worden gescheurd met een scherpe tang, zodat het embryo ontstaat intact. Een ander belangrijk precaution is om zorgvuldig de cellen plaatsen op de bodem van de cultuur schotel (in plaats van hen te laten zich daar te vestigen). Deze methode heeft de voorkeur aangezien dit de kans dat de cellen zich aan de kweekschaal.
Functionele neurotransmissie tussen zenuw en spier worden bepaald met slechts postsynaptische opname en vaak worden vastgesteld door de observatie van spontane spiercontractie na innervatie. Un-geïnnerveerde spiercellen niet trillen in cultuur. Postsynaptische opname alleen is handig voor het opnemen miniatuur eindplaat stromen of mogelijkheden, maar metingen van evoked afschakelspoel heeft presynaptische stimulatie en de correlatie van pre-en postsynaptische stromingen vereist dubbele patch-clamp.
Naast de gepaarde patch opnamewerkwijze hier beschreven, dit preparaat biedt de mogelijkheid om een derde pipet voeren op de neuronale soma 5 Dit maakt het genereren van een actiepotentiaal that kan doorgeven aan de presynaptische varicosity en leiden tot het vrijkomen van neurotransmitter. Bovendien kunnen mogelijke middelen die worden verondersteld te bemiddelen of moduleren synaptische transmissie worden geïntroduceerd aan beide zijden van de synaps: via de spiercel pipet of door diffusie uit een derde pipet geplaatst op de soma.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Gefinancierd door de NSF (0854551).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||
| Insulin-Transferrin-Selenium | Sigma | I1884 | |||||||||||||||
| Human Chorionic Gonadotropin | Sigma | CG-10 | |||||||||||||||
| Vapor Pressure Osmometer | Wescor | 5100C | |||||||||||||||
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |||||||||||||||
| Amphotericin B | Sigma | A4888 | |||||||||||||||
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |||||||||||||||
|
|||||||||||||||||
Table 1. |
|||||||||||||||||
References
- Augustine, G. J., Eckert, R. Divalent cations differentially support transmitter release at the squid giant synapse. J. Physiol. 346, 257-271 (1984).
- Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641 (1976).
- Weldon, P. R., Cohen, M. W. Development of synaptic ultrastructure at neuromuscular contacts in an amphibian cell culture system. J. Neurocytol. 8, 239-259 (1979).
- Tabti, N., Poo, M. -M. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, Massachusetts. 137-153 (1991).
- Yazejian, B., DiGregorio, D. A., Vergara, J. L., Poage, R. E., Meriney, S. D., Grinnell, A. D. Direct measurements of presynaptic calcium and calcium-activated potassium currents regulating neurotransmitter release at cultured Xenopus nerve-muscle synapses. J. Neurosci. 17, 2990 (1997).
- DiGregorio, D. A., Peskoff, A., Vergara, J. L. Measurement of action potential-induced presynaptic calcium domains at a cultured neuromuscular junction. J. Neurosci. 19, 7846 (1999).
- Yazejian, B., Sun, X. P., Grinnell, A. D. Tracking presynaptic Ca2+ dynamics during neurotransmitter release with Ca2+-activated K+ channels. Nat. Neurosci. 3, 566 (2000).
- Sun, X. P., Chen, B. M., Sand, O., Kidokoro, Y., Grinnell, A. D. Depolarization-induced Ca2+ entry preferentially evokes release of large quanta in the developing Xenopus neuromuscular junction. J. Neurophysiol. 104 (5), 2730-2740 (2010).
- Xie, S. P., Poo, M. M. Initial events in the formation of neuromuscular synapse: rapid induction of acetylcholine release from embryonic neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7069 (1986).
- Li, P. P., Chen, C., Lee, C. W., Madhavan, R., Peng, H. B. Axonal filopodial asymmetry induced by synaptic target. Mol. Biol Cell. 22 (14), 2480-2490 (2011).
- Feng, Z., Ko, C. P. Schwann cells promote synaptogenesis at the neuromuscular junction via transforming growth factor-beta1. J. Neurosci. 28 (39), 9599-9609 (2008).
- Song, H. J., Ming, G. L., Poo, M. M. cAMP-induced switching in turning direction of nerve growth cones. Nature. 17 (6639), 275-279 (1997).
- Morimoto, T., Wang, X. H., Poo, M. M. Overexpression of synaptotagmin modulates short-term synaptic plasticity at developing neuromuscular junctions. Neuroscience. 82 (4), 969-978 (1998).
- Lu, B., Czernik, A. J., Popov, S., Wang, T., Poo, M. M., Greengard, P. Expression of synapsin I correlates with maturation of the neuromuscular synapse. Neuroscience. 74 (4), 1087-1097 (1996).
- Schaeffer, E., Alder, J., Greengard, P., Poo, M. M. Synapsin IIa accelerates functional development of neuromuscular synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 26 (9), 3882-3886 (1994).
- Liou, J. C., Tsai, F. Z., Ho, S. Y. Potentiation of quantal secretion by insulin-like growth factor-1 at developing motoneurons in Xenopus cell culture. J. Physiol. 553 (Pt. 3), 719-7128 (2003).
- Peng, H. B., Yang, J. F., Dai, Z., Lee, C. W., Hung, H. W., Feng, Z. H., Ko, C. P. Differential effects of neurotrophins and schwann cell-derived signals on neuronal survival/growth and synaptogenesis. J. Neurosci. 23 (12), 5050-5060 (2003).
- Dan, Y., Poo, M. M. Hebbian depression of isolated neuromuscular synapses in vitro. Science. 12 (5063), 1570-1573 (1992).
- Xiao, Q., Xu, L., Spitzer, N. C. Target-dependent regulation of neurotransmitter specification and embryonic neuronal calcium spike activity. J. Neurosci. 30 (16), 5792-5801 (2010).
- Niewkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , North-Holland, Amsterdam. (1967).
