Это видео демонстрирует процедуры используются для выращивания первичных культур эмбриональных<em> Xenopus</em> Нервных и мышечных клеток и полезности этого препарата для изготовления одновременным пре-и пост-синаптические записи патч зажим.
Много информации о связи пресинаптических ионные токи с выделением нейромедиатора, была получена из беспозвоночных препаратов, в первую очередь гигантского кальмара синапса 1. Однако, за исключением подготовки описано здесь, несколько препаратов позвоночных существуют в котором можно сделать одновременные измерения высвобождение нейротрансмиттеров и пресинаптических ионные токи. Эмбриональные Xenopus мотонейронов и мышечных клеток можно выращивать вместе в простой питательной среде при комнатной температуре, они будут образовывать функциональные синапсы в течение двенадцати до двадцати четырех часов, и может быть использовано для изучения нервных и мышечных клеток и развитие синаптических взаимодействий в течение нескольких дней (до разрастание происходит). Некоторые преимущества этих совместных культур по сравнению с другими препаратами позвоночных включает простоту подготовки, способность поддерживать культуру и работы при комнатной температуре, и готово доступности синапсов сформированы 2-4. Препарат широко используется для изучения биофизических свойств ионных каналов пресинаптической и регулирования медиатора 5-8. Кроме того, препарат поддается других применений, включая изучение роста аксонов и синаптогенез 9-12, молекулярные механизмы нейротрансмиттеров 13-15, роль диффузии послов в нейромодуляции 16,17, а в пробирке синаптической пластичности 18 – 19.
Основные этапы успешного сотрудничества культивирования мотонейронов и мышечных клеток является использование надлежащего поставил эмбрионов, полученных от наведенного разведение лягушек Xenopus, и тщательный асептический рассечение недифференцированные нейроны спинного и миобластов. Оплодотворенные яйца должны быть оставлены нетронутыми, пока они не достигают примерно стадии 10 или около того, как перемещение их раньше часто останавливает их развитие. Здоровый эмбрионов, определенных гладкий внешний вид и коричневый и белый пестрая окраска. Этап 22-24 эмбрионы являются наиболее полезными, потому что это точка в процессе разработки сразу же после закрытия нервной трубки и перед миоцитов были дифференцированы значительно. Кроме того, клетки из эмбрионов старше не в состоянии отделить и в СЦМ. Следует проявлять осторожность при снятии желточной оболочки, как он придерживается сильно эмбриона. Мембрана должна быть раздираемой острыми щипцами, так что зародыш возникает нетронутыми. Другим важным precautioп тщательно поместить клетки на дно культуры блюдо (а не позволив им поселиться там). Этот метод является предпочтительным, так как это увеличивает вероятность того, что клетки будут придерживаться культуры блюдо.
Функциональные нейротрансмиссии между нервной и мышечной может быть определена только с постсинаптической записи и часто может быть установлено путем наблюдения спонтанного сокращения мышц после иннервации. Un-иннервируемых клеток не дергаться в культуре. Постсинаптические запись сама по себе полезна для записи миниатюрных токов концевой пластинки или потенциалы, но измерении вызвало освобождение требует стимуляции пресинаптического, и соотношение пре-и постсинаптических токов требует двойной патч-зажим.
Кроме того, парные патч записи метод, описанный здесь, этот препарат дает возможность ввести третий пипетки на сомы нейронов 5 Это позволяет генерировать потенциал действия, тхат может распространиться на пресинаптические варикозной болезни и привести к выбросу нейромедиатора. Кроме того, предполагаемые агенты, которые, как полагают, посредником или модулировать синаптическую передачу могут быть введены в обе стороны синапса: с помощью пипетки мышечных клеток путем диффузии или от третьего пипетки помещают на сомы.
The authors have nothing to disclose.
При финансовой поддержке NSF (0854551).
Equipment/Supplies | Vendor | Catalogue/Model Number | |||||||||||||||
Insulin-Transferrin-Selenium | Sigma | I1884 | |||||||||||||||
Human Chorionic Gonadotropin | Sigma | CG-10 | |||||||||||||||
Vapor Pressure Osmometer | Wescor | 5100C | |||||||||||||||
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |||||||||||||||
Amphotericin B | Sigma | A4888 | |||||||||||||||
Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |||||||||||||||
|
Table 1.