Denna video demonstrerar de förfaranden som används för att odla primära kulturer av embryonala<em> Xenopus</em> Nerv-och muskelceller och nyttan av detta preparat för att göra samtidiga pre-och post-synaptiska inspelningar patch clamp.
Mycket information om koppling av presynaptiska jonströmmar med lanseringen av signalsubstansen har erhållits från ryggradslösa preparat, främst bläckfisk jätten synaps 1. Men med undantag för framställning som beskrivs här, några ryggradsdjur beredningar existerar, i vilket det är möjligt att göra samtidiga mätningar av neurotransmittorfrisättning och presynaptiska jonströmmar. Embryonala Xenopus motoneuroner och muskelceller kan odlas tillsammans i enkla odlingsmedium i rumstemperatur, de kommer att bilda funktionella synapser inom 12-24 timmar och kan användas för att studera nerv-och muskelceller utveckling och synaptiska interaktioner i flera dagar (tills överväxt sker). Några fördelar med dessa samkulturer över andra ryggradsdjur preparat inkluderar enkelhet beredningen, möjligheten att bibehålla kulturer och arbete vid rumstemperatur, och den färdiga tillgängligheten av synapserna bildade 2-4. Beredningen har används i stor utsträckning för att studera de biofysiska egenskaperna hos presynaptiska jonkanaler och reglering av transmittorfrisättning 5-8. Dessutom har beredningen lånat sig till annan användning, inklusive studier av neuritutväxt och synaptogenes 9-12, molekylära mekanismer neurotransmitterfrisättning 13-15, roll diffunderbara budbärare i neuromodulering 16,17, och in vitro synaptisk plasticitet 18 – 19.
Viktiga steg i den framgångsrika samodling av motoneuroner och muskelceller är användningen av lämpligt arrangerade embryon framställda av den inducerade uppfödning av Xenopus grodor och försiktig aseptisk dissektion av odifferentierade spinala neuron och myoblaster. Befruktade ägg bör lämnas orörd tills de når ungefär steg 10 eller så flytta dem förr ofta stoppar deras utveckling. Friska embryon identifieras av ett jämnt utseende och en brun och vit melerad färg. Etapp 22-24 embryon är de mest användbara eftersom detta är den punkt under utveckling strax efter neuralrörsdefekter stänger och innan myocyter har differentierat betydligt. Dessutom celler från äldre embryon inte skilja bra i CMF. Försiktighet bör iakttas vid demontering av vitellinmembranet som fäster starkt till embryot. Membranet ska slitas sönder med vassa tänger så att embryot framträder intakt. En annan viktig precaution är att noggrant placera cellerna på botten av odlingsskålen (snarare än att låta dem sedimentera där). Denna metod är att föredra eftersom detta ökar sannolikheten för att cellerna skall häfta vid odlingsskålen.
Funktionell neurotransmission mellan nerv och muskel kan bestämmas med bara postsynaptiska inspelning och ofta kan fastställas genom observation av spontan muskelsammandragning efter innervation. Un-innerverade muskelceller inte rycka inte kultur. Postsynaptiska inspelning ensam är användbart för inspelning miniatyr gavel strömmar eller potentialer men mätningar av framkallade utsläpp kräver presynaptisk stimulering och korrelation av pre-och postsynaptiska strömmar kräver dubbel patch-clamp.
Förutom parade patch inspelning som beskrivs här, erbjuder detta preparat möjlighet att införa tredjedel pipett på den neuronala soma 5 Detta tillåter alstring av en aktionspotential THAt kan propagera till den presynaptiska åderbråck och leda till frisättning av signalsubstans. Dessutom, kan förmodade medel som tros förmedla eller modulera synaptisk överföring kan införas på endera sidan av den synaps: via muskelcellen pipetten eller genom diffusion från en tredje pipett placeras i soma.
The authors have nothing to disclose.
Finansierat av NSF (0.854.551).
Equipment/Supplies | Vendor | Catalogue/Model Number | |||||||||||||||
Insulin-Transferrin-Selenium | Sigma | I1884 | |||||||||||||||
Human Chorionic Gonadotropin | Sigma | CG-10 | |||||||||||||||
Vapor Pressure Osmometer | Wescor | 5100C | |||||||||||||||
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |||||||||||||||
Amphotericin B | Sigma | A4888 | |||||||||||||||
Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |||||||||||||||
|
Table 1.