Summary
우리는 여기서 보여
Abstract
말초 동맥 질환의 동물 모델에서 전임상 연구는 미세 혈관을 자극하도록 설계 치료제의 효능을 테스트하는 중요한 역할을합니다. 투여 경로 뿌리깊은 이러한 에이전트 1,2의 생리 활성과 효능에 영향을주기 때문에 이러한 에이전트에 대한 배송 방법의 선택이 중요합니다. 이 문서에서는, 우리는 로컬 catheterized 삼투 펌프를 사용하여 허혈성 뒷다리에있는 물질을 관리하는 방법을 보여줍니다. 이 펌프는 시간이 할당 된 기간 동안 지속적으로 수용액의 정량을 제공 할 수 있습니다. 우리는 또한 왼쪽 뒷다리에 profunda 대퇴 및 epigastrica 동맥의 기원에 인접 일반적으로 대퇴 동맥의 결찰에 의한 일방적 인 뒷다리 허혈 우리의 마우스 모델을 제시한다. 마지막으로, 우리는 Microfil, 실리콘 방사선 불 투과성 캐스팅 에이전트 infrarenal 복부 대동맥과 뒷다리의 혈관의 관류의 생체 도관 및 결찰에 대해 설명합니다. Microfil이 붓는다 및 채우기 전체 혈관 침대 (동맥과 정맥), 우리는 출구의 주요 혈관 도관 결찰했기 때문에 에이전트는 작은 표본 마이크로 CT 3의 사용과 향후 생체 이미징 혈관에서 유지 될 수있다 .
Introduction
말초 동맥 질환 (PAD)는 다리 4 불충분 한 혈액 공급을 일으키는 동맥 경화성 질환입니다. 그것은 8-12000000 미국인에 영향을 미치는, 그리고 현재의 의료 치료는 제한된 구제 5,6을 제공합니다. 다리에 혈액 순환을 개선하는 새로운 치료제는 질병의 진행을 억제뿐만 아니라 삶의 질을 향상하지 않을 것입니다. 종종 노인 환자에서 볼 수 감소 신장과 간 기능이 약의 대사를 감소시키고 조직 관리와 부작용을 증가시킬 수 있기 때문에 PAD의 발생 50 세 이상의 사람에서 더 높은, 그래서 지역 약물 치료는 더 바람직한 치료 방법이다.
따라서, 우리는 로컬에서 관리 에이전트가 혈관 및 미세 혈관의 리모델링을 촉진하여 뒷다리 허혈을 완화 여부를 검사하는 PAD의 마우스 모델을 만들었습니다. 특히, 우리는 지속적으로 치료제를 제공 할 catheterized 삼투 펌프를 사용쥐의 허혈성 허벅지 근육. 우리의 배달 시스템을 사용하여, 우리는 로컬 환경에서 약물의 최적 농도를 유지할 수 있었다;이 방법은 적절한 약물 생리 활성을 허용 가능한 전신 부작용을 피하고, 전신 관리와 관련된 제한 지역 마약 액세스의 단점을 극복한다. 또한, 로컬 관리 에이전트가 시술을 촉진 여부를 평가하기 위해, 우리는 진보 된 주조와 미세 혈관의 변화를 정량화를 가능하게 고화질 영상 기법을 사용했다. 종합적으로,이 비디오 문서에서 사용되는 방법론의 조합은 PAD 환자에 7-9 약리학 유도 시술을 이해하는 데 도움이되는 전임상 연구에 유용합니다.
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Protocol
1. 프라이밍 삼투 펌프
- 펌프를 준비 할 때 무균 기법 (예 : 장갑, 층류 후드)를 사용합니다. 포장의 펌프와 유량 사회자를 제거합니다. 빈 펌프를 달아 무게 (MG)를 기록합니다.
- 작은 1CC 주사기와 뭉툭한 팁 27G 충전 튜브를 사용하여 공기 방울을 만드는 피하기 위해 천천히 펌프를 채우십시오. 솔루션은 펌프의 상단에 도달하면 충전 중지합니다.
- 과량의 용액을 닦아 채워진 펌프를 무게. 대부분의 수성 솔루션, MG의 무게 μL의 볼륨과 동일합니다. 빈 대 채워진 무게의 차이는 지정된 평균 충전량의 90 % 이상이어야한다. 그렇지 않은 경우, 주사기와 리필 펌프를 대피. 당신이 기술적 인 어려움을 경험하는 경우하시기 바랍니다 http://www.alzet.com/products/guide_to_use/filling.html에서 펌프 설명서의 문제 해결 단원을 참조하십시오
- 흐름 moderat에서 흰색 플랜지를 깰 포셉 한 켤레를 사용또는, 관 구부리거나 분쇄하지 않도록주의해야합니다. 3-4mm에 대해 취재 운영자의 한쪽 끝을 P50 카테터를 연결합니다. 카테터 및 연결된 운영자를 작성하고 카테터의 원위부에 부착 된 주사기를 남길 수있는 주사기를 사용합니다.
- 카테터 펌프 표면에 닿을 때까지 펌프에 흐름 사회자를 삽입합니다. 그런 다음, 카테터의 말단부에서 주사기를 제거합니다. 프라임 6 시간의 최소 (바람직 O / N) 마우스에 그것을 주입하기 전에 펌프에 대해 37 ° C 배양기에서 무균 0.9 %의 식염수 또는 PBS 용액에 펌프를 놓습니다. 펌프 전달 속도는 모델 번호 (예 : 모델 1002 = 14 일 동안 0.25 μL / HR).에 따라 달라집니다
2. 마우스의 일방적 인 뒷다리의 허혈 만들기
- 0.4 L / min의 유량에서 100 % O 2에있는 2-4 % 범위 isoflurane을 세트로 쥐를 마취하고 depilato와 뒷다리 다시 영역 (가급적 수술 전 날) 머리를 제거스피 크림.
- 수술 전에 수술 도구를 소독. 유도 마취 챔버에 마우스를 놓습니다. 2.1 절에서 설명 된 것과 동일한 마취 설정을 사용합니다.
- 마우스가 외부 자극에 비 반응하고 isoflurane을의 연속 흐름 (1.5 ~ 2.0 %)을 제공하는 장착 노즈 콘 수술대에 발생하기 쉬운 위치에 배치 될 때까지 기다립니다.
- 절개 사이트에서, 마취의 권장 용량 (0.25 % (<1 ML / kg) 부피 바카 인)를, 주사 70 % 에탄올 다음 포비돈 - 요오드 용액으로 피부를 취급합니다. 다시 (척추의 측면에서, 견갑골 지역)에 4-6 밀리미터 절개를합니다. 미세 집게로 피하 막 분리 한 후 앙와위로 마우스를 켜 70 % 에탄올 다음과 내측 허벅지쪽으로 무릎 위의 마이크로 수술 가위로 0.8-1 cm의 절개를 포비돈 - 요오드 용액으로 피부를 치료, 대퇴 동맥의 경로를 따라.
- 최대 터널뒷면에 절개 내측 허벅지에서 작은 칼집 튜브 (6 프랑스어)와 몸통의 측면.
- 쉬운 위치에 마우스를 놓습니다. PBS 용액에서 준비하는 삼투 펌프 / 카테터를 제거하고 허벅지, 칼집 관을 통해 카테터를 안내합니다.
- 안으로 펌프를 배치하고 6-0 prolene의 봉합 (70 % 에탄올 다음 포비돈 - 요오드 용액으로 피부를 치료)를 다시 절개를 닫습니다. 앙와위에서 마우스를 다시 놓고, 허벅지 절개를 통해 노출 카테터를 떠나, 칼집 튜브를 제거합니다. 외과 테이프로 다리를 고정합니다.
- 혈관을 나타 내기 위해 피하 지방 조직을 분리합니다. 더 나은 혈관을 시각화하기 위해 절개를 열고 견인기를 사용합니다.
- 혈관 번들을 액세스하는 미세 뾰족한 집게를 사용하여 부드럽게 피어스 막 대퇴 칼집. 해부 사타구니 근처의 대퇴 정맥 및 신경에서 대퇴 동맥을 분리 일으키는 원인이되지 않도록주의 예과도한 출혈.
- 장소 두 8-0 prolene의 봉합 인접 대퇴 동맥에게 대퇴 분기 (profunda 대퇴 및 epigastrica 동맥의 기원)에 인접 2-3밀리미터을 중단 할 수 있습니다.
- 적당한 길이로 카테터를 잘라 물질의 타겟 배달을 보장하기 위해 표면 근막에 6-0 prolene의 봉합으로 고정, 허벅지의 외측 영역으로 끝을 놓으십시오. 6-0 실행 봉합과 다리 절개를 닫습니다. 진통제의 최종 피하 주사 (부 프레 놀핀, 0.1 ㎎ / ㎏)를 관리, 70 % 에탄올 다음 포비돈 - 요오드 용액으로 피부를 치료하고 새장에 마우스를 반환합니다. 복구하는 동안 가열 램프를 사용합니다.
- 30 분 회복 기간 후, 뒷다리 허혈의 생성을 확인하는 레이저 도플러 이미징 마우스를 준비합니다.
- 매일 두 번 수술 후 5 일을위한 동물을 모니터링 할 수 있습니다. 동물의 이동성은 고통을 분석하는 관찰 될 것이다 케이지 폐기물 인도어 될 것입니다먹는 ATOR. 동물이 통증이나 불편을 경험하는 경우 또한 모니터 기간 동안 확인하고 하루에 두 번 부 프레 놀핀 (0.1mg/kg)의 피하 주사를 제공합니다.
3. 이미징 표본 준비
- 2.1 절에 명시된 바와 같이 마우스를 마취. 앙와위에서 운영 테이블 위에 마우스를 전송합니다. 피하 혈관에 응고 방지하기 위해 헤파린 1,000 IU를 주입한다. 마우스가 노즈콘에 연결되어있는 동안, 흉강 및 낮은 복부를 노출하기에 충분히 큰 절개를합니다. infrarenal 복부 대동맥 (IAA)를 노출 동물의 왼쪽 복부 장기를 이동합니다. 열등 정맥 정맥에서 대동맥을 조심스럽게 분리합니다.
- 카테터 삽입시 출혈을 줄이기 위해 인접 IAA를 결찰. 그런 다음, IAA에 작은 절개를합니다. IAA에 ½ G 무딘 바늘 (P10 카테터에 부착) 27를 삽입하고 6-0 봉합사로 고정.
- 기입 두헤파린 식염수와 10 % 중성 20CC 주사기 (NBF) 포르말린. 대비 방사선 불 투과성 실리콘 고무 화합물 5CC 주사기를 채우십시오. MV-희석제 : 1:1.25:0.5의 작업 비율의 MV-경화제 MV-화합물의 세 가지 재료를 혼합. 에이전트가 중합하기 전에 혼합물 (Microfil)은 단지 20 분의 작업 시간을 가지고 있기 때문에, 그것은 혈관에 주입 직전까지 MV-경화제를 추가하지 않는 것이 좋습니다.
- 오른쪽 심방에 상처를 확인하고 안락사를 유도하는 과잉 액체의 배수 수 있도록 isoflurane을의 과다 복용을 관리 할 수 있습니다. 바늘 끝을 식염수로 채워진 주사기를 연결하고 5 분 동안 혈관을 세척하기 시작합니다. 모든 혈액이 혈관 밖으로 플러시되어 있는지 확인합니다, isoflurane을을 해제하고 세척이 시작되면 노즈콘을 분리합니다. 다음으로, 위에 설명 카테터 (3.2)과 추가로 5 분간 압력 붓는다에 포르말린으로 채워진 주사기를 연결합니다. 마지막으로, 콘트라스트, 마지막 주사기를 붓는다천천히 5 분 마우스로 에이전트.
- 선택 사항 : 사진 카메라 혈관에 Microfil은 혈관 구조가 관류되어 있는지 확인합니다.
- 4에서 10 % NBF 및 저장 ° CO / 조영제 중합 N 가득 용기에 마우스를 놓습니다. 24 시간 후, 해부 도구를 사용하여 몸통의 아래쪽 절반 (복부 대동맥 결찰 원위부)에 피부를 제거 10 % NBF를 새로하고, 실온에서 4 일 이상 용기에 다시 마우스를 놓습니다.
- 반대측과 허혈성 뒷다리를 해부하고, 뼈의 탈회를 촉진하기 위해 48 시간 동안 개미의 산성 용액 (칼 - 예 II)의 표본을 배치합니다. 그런 다음, 1 시간 및 10 % NBF에 반환 흐르는 물에서 표본을 씻어 Faxitron (X-레이 시스템 골이 탈회되어 있는지 확인하는 데 사용)와 마이크로-CT 영상과 함께 진행합니다.
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Representative Results
애니메이션은 프로토콜에 설명 된 삼투 펌프 삽입 및 뒷다리 허혈 수술을 보여줍니다. 그림 1은 허혈을 확인, 뒷다리의 관류의 레이저 도플러 영상을 보여줍니다. Microfil와 혈관 캐스팅 후 혈관 네트워크의 3D 마이크로 CT 이미지 Microfil (그림 2A) 효과적으로 혈관을 채울 수 있음을 보여줍니다하지만 불연속 (예를 들면, 기포의 부족으로 여러 절차 요인으로 인해 (그림 2B)가 발생할 수 있습니다 Microfil의 압력, 점도).
애니메이션 전설
- 쉬운 위치에 마우스를 놓고 그 뒤 척추의 측면에 절개를합니다.
- 작은 백 절개를 노출합니다.
- 부정사 위치에 마우스를 놓고 내측 허벅지에서 무릎 위의 작은 절개를합니다.
- 피부를 분리, 혈관을 노출하고, 양해 각서의 측면 몸통쪽으로 칼집 튜브를 삽입다시 절개 전자.
- 삼투 펌프를 가지고 칼집 튜브에 카테터를 삽입합니다.
- 부정사 위치에 마우스를 놓고 허벅지 절개 튜브를 통해 카테터를 안내합니다.
- 쉬운 위치에 마우스를 놓고 그 뒷면에있는 펌프를 배치하고 절개를 닫습니다.
- 부정사 위치에 마우스를 놓고 칼집 튜브를 제거합니다.
- 견인기로 피부를 당겨 동맥에서 정맥을 분리하는 미세 도구를 사용합니다. 봉합사와 대퇴 분기점 위의 대퇴 동맥을 결찰 두 번.
- 허벅지의 표면 조직에 카테터를 고정합니다.
- 봉합 다리 절개를 닫습니다.
그림 1. 레이저 도플러 혈류 영상을 통해 뒷다리 허혈의 확인. 대표 도플러 영상 소W 마우스 뒷다리의 대퇴 동맥의 결찰 수술 전후의 혈액 관류. 허혈 (화살표 참조) 왼쪽 뒷다리에 만들어졌습니다.
그림 2. Microfil와 뒷다리 혈관의 3 차원 마이크로 - CT 이미지. 혈관 캐스팅 뒷다리 (A)에 걸쳐 정맥과 동맥의 네트워크를 계시한다. Microfil의 불연속성은 (B), 자세한 혈관 네트워크의 시각화를 비활성화하면 (화살표 참조)가 발생할 수 있습니다.
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Discussion
여기에서 우리는 뒷다리 허혈의 마우스 모델에서 삼투압 약물 / 물질 전달을위한 방법을 제시한다. 또한, 우리는 우리가 혈관 네트워크 분석을위한 3D 재구성을 생산하는 Microfil을 사용하고있는 주조 기술을 설명합니다.
허혈의 수준이나 정도는 동맥 결찰술 / 절단이 이루어진 위치에 따라 다릅니다. 우리는 profunda 대퇴 및 epigastrica 동맥의 기원에 인접 일반적으로 대퇴 동맥에서 이중 결찰을 만들어,이 방법은 말초 뒷다리에 더 심한 빈혈을 생성 할 수 있습니다. 수술 후 동물을 모니터링하고 진통제의 로컬 관리로 통증 완화를 제공해야합니다. 또한, Microfil는 항상 완전히 사지 혈관을 붓는다하지 않을 수 있습니다. 따라서, 모든 혈액 헤파린 생리 식염수를 관류 한 후 혈관 밖으로 씻어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. Microfil의 불완전 관류에 대한 이유의 부족을 포함pplied 압력 Microfil의 부적절한 점도, 둘은 Microfil는 뒷다리의 가장 말단 지역에 도달 할 수 있도록 충분하고 따라서 전체 혈관을 채 웁니다해야합니다. 특정 동물의 응용 프로그램에 대한 희석 비율 : 이러한 문제를 해결하기 위해, 화합물 100 mmHg로 실험에서 일관된 압력을 적용합니다.
arteriogenesis (기존 담보 동맥의 성장)을 연구하기 위해 이상적인 방법은 측부 혈관에 혈액 흐름을 리디렉션 깊은 대퇴 분기의 원점에 바로 원위부 대퇴 동맥을 결찰하는 것입니다. 그러나이 절차에 대한 응답 마우스 변종 사이에서 넓게 변화 및 허혈의 정도 (예를 들어, C57BL / 6) 일부 마우스 계통에 불충분 할 수 있습니다. 덜 심각한 허혈 모델은 C57BL / 6로 크게 혈관 마우스 변종 치료 효과를 조사하기 위해 오랜 시간 창을 제공 할 수 없습니다. 이러한 문제를 방지하기 위해, 우리는 뒷다리 허혈 b를 생성Y는 더 나은 지역 약물 방출 효과를 입증하는 더 심한 허혈을 만들어 근위 대퇴 동맥을 결찰하지만,이 방법은 근위 깊은 지점 측부 혈관 arteriogenesis의 분석을 배제. 따라서, 치료 효과는 약물 / 물질이 방출되는 해부학 적 위치 (외측 허벅지)과 일치하는 말초 허혈 지역에서 주로 그려집니다. 지역 출혈이 염증과 arteriogenesis과 혈관 모두에 영향 부종으로 이어질 수 있기 때문에 수술하는 동안, 그것은 허약 한 대퇴 정맥을 손상하지 중요합니다. 우리는 스트레칭, 스트레인, 또는 동맥의 파열을 방지하기 위해 적절한 매듭 넥타이 대퇴 동맥을 결찰하는 8-0 prolene의 봉합을 사용하는 것이 좋습니다. 또한, Microfil는 빠르게 주입을위한 기술적 인 문제를 생성하는 중합 때문에 3 성분 (합성, 희석제 및 경화제) 혼합 한 후 (20 분 이내) 즉시 사용할 수 있어야합니다. 이전에 역으로테드, Microfil은 항상 성공적으로 작은 혈관을 붓는다하지 않지만, 적절한 기술의 연습과 사용이 제한을 극복 할 수 있습니다.
펌프 채우기 볼륨은 평균 충전량의 90 % 이상이어야합니다하지 않을 경우, 별도의 공기가 펌프 안에 갇혀받을 수 있습니다. 자세한 기술 정보는 다음 위치에 있습니다 www.alzet.com . 또한, Microfil 에이전트가 특정 응용 프로그램에 대한 선호하는 점도해야하며, 화합물 희석제의 비율을 수정해야 않을 수 있습니다.
뒷다리 허혈 모델은 높은 재현성과 PAD 10,11에 적용됩니다. 이 모델 치료제의 안정적인 배달 정보 검색 결과 2를 얻을 필요가있다. 결론적으로, 우리는 형태 학적 구조를 시각화하는 데 사용되는 3D 영상 기술은 마우스 혈관을 조사하기위한 훌륭한 도구입니다 studyi위한 강력한 시스템을 제공합니다NG 혈관 병리.
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Disclosures
저자는 이익에 대한 갈등을 선언하지 않습니다. 모든 동물의 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 수행되었다 휴스턴 텍사스 건강 과학 센터의 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
Acknowledgments
저자는 편집 지원을위한 마이크로 CT 수술 지원 영상, 에드워드 TH 예치, MD, 레베카 바토, 박사와의 기술 지원을위한 MD 앤더슨 작은 동물 이미징 시설의 키스 미셸에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 미국 심장 협회 (American Heart Association)에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Surgical tools | Fine Science Tools | Type: Tool | |
| Puritan sterile cotton swabs | Fisher Scientific | 22-029-499 | Type: Tool |
| Betadine (povidone-iodine) | Fisher Scientific | 19-065534 | Type: Reagent |
| 70% Alcohol pads | Fisher Scientific | NC9926371 | Type: Reagent |
| Phosphate buffered saline | Lonza | 17-516F | Type: Reagent |
| 6-0 prolene suture | Cardinal Health | 8709 | Type: Tool |
| 8-0 prolene suture | Cardinal Health | 2775 | Type: Tool |
| Depilatory cream | Nair | Type: Tool | |
| Osmotic pump |  ALZET |
1002 | Type: Tool, 14 day release |
| Vinyl catheter | ALZET |
7760 | Type: Tool |
| Heparinized saline (0.9%) | Baxter | 2B0944 | Type: Reagent |
| Neutral buffered formalin | Richard-Allan Scientific | 5705 | Type: Reagent |
| Microfil (silicone rubber contrast agent) | Flowtech | MV-112 | Type Reagent, Microfil White |
| Cal-Ex II (formic acid solution) | Fisher Scientific | CS511-1D | Type: Reagent |
| Buprenex | CIII | 7571 | Type: Analgesic |
| Bupivicaine | Hospira, Inc. | 381 | Type: Analgesic |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Carl Zeiss Microimaging | Zeiss Stemi 2000-C | Type:Equipment |
| Laser Doppler perfusion imager | Perimed Inc. | Periscan PIM3 | Type:Equipment |
| Micro-CT imaging system | GE Healthcare | Explore Locus SP | Type:Equipment |
References
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