Summary
Здесь мы показываем,
Abstract
Доклинические исследования на животных моделях заболевания периферических артерий играет жизненно важную роль в тестировании эффективности терапевтических агентов призван стимулировать микроциркуляцию. Выбор способ доставки для этих агентов важно, потому что путь введения оказывает глубокое воздействие на биологическую активность и эффективность этих 1,2 агентов. В этой статье мы покажем, как для локального управления вещество при ишемическом задние конечности с помощью катетера осмотического насоса. Этот насос может обеспечить фиксированный объем водного раствора непрерывно в течение выделенного периода времени. Мы также представляем нашу модель мыши односторонних ишемии задней конечности смоделирован посредством перевязки общей бедренной артерии проксимальнее происхождение Profunda бедра и epigastrica артерий в левой задней конечности. Наконец, мы опишем в естественных условиях и катетеризация перевязка брюшной аорты инфраренальной и перфузии сосудистой задних конечностей с Microfil, литья силиконовых рентгеноконтрастный агент. Microfil можно заливать при заполнении всего сосудистого русла (артериальные и венозные), а также потому, что мы лигировали основных сосудистых каналом для выхода, агент может быть сохранена в сосудах для будущего бывших естественных изображений с использованием небольшого образца микро-CT 3 .
Introduction
Болезнь периферических артерий (PAD) является атеросклеротическая болезнь, которая вызывает недостаточное кровоснабжение в ногах 4. Она затрагивает от 8 до 12 миллионов американцев, и современные медицинские процедуры предлагают лишь ограниченный рельефа 5,6. Новые терапевтические агенты, которые улучшают циркуляцию крови в ногах не только сдерживать прогрессирование заболевания, а также повысить качество жизни. Заболеваемость PAD выше у людей в возрасте старше 50 лет, так что местные фармакологической терапии является более желательным, потому что метод лечения сниженной функции почек и печени часто наблюдается у пожилых пациентов может снижаться метаболизм лекарств и увеличения побочных эффектов при системном введении.
Таким образом, мы создали модель мыши PAD изучить вопрос локально вводимых средств облегчить ишемии задней конечности путем стимуляции ангиогенеза и микрососудистых ремоделирования. В частности, мы использовали катетер осмотического насоса постоянно предоставлять терапевтического агентаишемический мышца бедра мышей. Используя наши системы доставки, мы были в состоянии поддерживать оптимальные концентрации препарата в местной среде; Такой подход позволяет соответствующей биологической активности препарата, позволяет избежать возможных системных побочных эффектов, и преодолевает недостаток ограниченный локальный доступ наркотиков, связанные с системным введением. Кроме того, для оценки того местно вводимых средств способствовать реваскуляризации, мы использовали передовой литья и высокой четкости методов визуализации, которые позволяют количественной оценки изменений в микрососудов. Коллективно, сочетание методологии, используемые в этом видео статья полезна в доклинических исследованиях, чтобы помочь в понимании фармакологически индуцированных реваскуляризации у пациентов PAD 7-9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Грунтовка осмотического насоса
- Используйте стерильные методов (например, перчатки, ламинарный шкаф) при подготовке насосов. Удалить насоса и поток замедлитель из упаковки. Взвешивают пустой насоса и записать вес (мг).
- Заполните насос медленно, чтобы не создавать пузырьки воздуха, с помощью небольшого 1cc шприц и с тупым концом 27G заполнения трубы. Когда температура раствора достигает верхней части насоса, остановка наполнения.
- Сотрите избыток раствора и весят заполненном насосе. Для большинства водных растворов, вес в мг такое же, как и объем в мкл. Разница в пустой по сравнению с заполненными вес должен быть больше, чем 90% от указанного среднего объема заполнения. Если нет, эвакуировать насоса со шприцем и пополнения счета. Если у вас возникли технические трудности пожалуйста, обратитесь к разделу Устранение неисправностей насоса инструкциям на http://www.alzet.com/products/guide_to_use/filling.html
- Используйте пинцет, чтобы разорвать белый фланец из потока Moderatили, будьте осторожны, чтобы не погнуть или подавить трубки. Установить P50 катетер к любому концу ведущего, охватывающих около 3-4 мм. С помощью шприца для заполнения катетера и прикрепленный модератора и оставить шприца прикреплен к дистальной части катетера.
- Вставьте поток замедлитель в насос, пока катетер не будет заподлицо с поверхности насоса. Затем удалите шприц из дистального конца катетера. Установить насос в стерильном 0,9% физиологического раствора или раствора в PBS при 37 ° C инкубаторе в течение не менее 6 часов (предпочтительно O / N) в основной насос перед имплантацией ее в мыши. Производительность насоса доставки варьируется в зависимости от номера модели (т.е. модели 1002 = 0,25 мкл / ч в течение 14 дней).
2. Создание Односторонние ишемии задних конечностей у мышей
- Обезболить мышей с изофлуран набор между 2-4% в 100% О 2 при скорости потока 0,4 л / мин и удаления волос (предпочтительно за день до операции) на задней конечности и заднюю зону с depilatoRY крем.
- Стерилизовать всех хирургических инструментов до операции. Наведите в камере вводного наркоза. Используйте те же настройки анестезии описаны в разделе 2.1.
- Подождите, пока мышь не не отвечающее на внешние стимулы, а затем поместить его в положении лежа на операционном столе с оборудована носовым обтекателем, которая обеспечивает непрерывный поток изофлурана (1,5-2,0%).
- Введите рекомендуемой дозы анестетика (бупивакаин, 0,25% (<1 мл / кг)) в месте разреза; лечения кожи с повидон-йод раствору с последующим добавлением 70% этанола. Сделать 4-6 мм разрез на спине (на стороне позвоночника, в лопатками область). Отделите мембраны подкожной тонким пинцетом, а затем включите мышь, чтобы положение на спине лечения кожи с повидон-йод раствором с последующим 70% этанола и сделать 0,8-1 см разрез с микро-хирургических ножниц выше колена к бедру медиальной, по пути бедренную артерию.
- Туннелебоковые части туловища с небольшой трубы оболочки (6-французский) с медиальной бедра до разрез на спине.
- Наведите в положении лежа. Удалить загрунтованных осмотического насоса / катетер из раствора PBS и направлять катетер, через оболочку трубы, в бедро.
- Насосный агрегат внутри задней и закрывать заднюю разрез 6-0 пролен шов (лечения кожи с повидон-йод раствором, а затем 70%-ного этанола). Наведите мышь обратно в положении на спине, снять оболочку трубы, оставляя катетер подвергается через разрез на бедре. Закрепите ноги с хирургической лентой.
- Отделите подкожной жировой клетчатки выявить сосудистую. Чтобы лучше визуализировать сосудистую, используйте втягивающим, чтобы открыть разрез.
- Пирс мембранной оболочки бедренной осторожно с помощью тонкой заостренной щипцы для доступа к сосудистого пучка. Проанализируйте и отделите бедренную артерию из бедренной вены и нервы возле паха, заботясь, чтобы не вызвать бывшегочрезмерных кровотечений.
- Поместите два 8-0 пролен соседних нитей, чтобы прервать бедренную артерию 2-3 мм проксимально по отношению к бедренной бифуркации (происхождение Profunda бедра и epigastrica артерии).
- Вырезать катетер к соответствующей длины и поместить кончик к переднебоковой области бедра, закрепив его с 6-0 проленовой шва к поверхностной фасции обеспечить адресную доставку вещества. Закройте ног разрез с 6-0 швом. Администрирование окончательный подкожной инъекции анальгетик (бупренорфина, 0,1 мг / кг), лечения кожи с повидон-йод раствором, а затем 70%-ным этанолом и вернуть мышь к клетке. Используйте нагревательную лампу во время восстановления.
- После 30-минутного периода восстановления, подготовки мышь для лазерной доплеровской визуализации для подтверждения создания ишемии задней конечности.
- Мониторинг животного два раза в день в течение 5 дней после операции. Подвижность животного будет наблюдаться для анализа боли; отходов в клетке будет служить индийскихАТОР еды. Кроме того, в течение периода мониторинга определить, является ли животное испытывает боли или дискомфорта, и дать подкожной инъекции бупренорфин (0.1mg/kg) дважды в день.
3. Подготовка изображений образца
- Обезболить мыши как указано в разделе 2.1. Перенесите мышью на операционном столе в положении на спине. Введите 1000 ЕД гепарина подкожно для предотвращения свертывания крови в сосудистой сети. В то время как мышь присоединена к головная часть, надрезают достаточно большой, чтобы подвергать грудной полости и нижней части живота. Перемещение органов брюшной полости с левой стороны животного подвергать инфраренального брюшной аорты (IAA). Осторожно отделить аорты от нижней полой вены.
- Лигировать проксимальных IAA для уменьшения кровотечения во время установки катетера. Затем сделайте небольшой надрез на IAA. Вставьте 27 G ½ тупой иглой (прилагается к катетеру P10) в IAA и закрепите его с 6-0 шва.
- Заполните два20cc шприцы с гепарином физиологического раствора и 10% нейтральный буферный формалин (НСБ). Заполните 5cc шприц с силиконовой резиновой смеси отличие рентгеноконтрастными. Смешайте три ингредиента МВ-соединения: MV-разбавителя: MV-отвердитель в соотношении рабочего 1:1.25:0.5. Поскольку смесь (Microfil) имеет только рабочее время 20 мин до агента полимеризуется, рекомендуется не добавить MV-отвердитель до момента, когда инъекции в сосудистой сети.
- Сделайте надрез в правом предсердии и администрирования передозировки изофлурана чтобы побудить эвтаназии и, чтобы обеспечить дренаж лишней жидкости. Приложить заполненный физиологическим раствором, шприц к игле и начинают промывать сосудистой сети в течение 5 мин. Убедитесь, что вся кровь вымываются из судов; выключите и отсоедините изофлурана головная как только начинается промывка. Затем прикрепить формалин заполненный шприц с катетером описано выше (3.2) и давление заливать в течение дополнительных 5 мин. Наконец, заливать последний шприц, с контрастомагент, медленно в мышь в течение 5 мин.
- Дополнительно: Фотография Microfil в сосудах с камерой, чтобы гарантировать, что только структура артериальной перфузии.
- Наведите в контейнер, заполненный 10% NBF и хранят при температуре 4 ° CO / N для контраста полимеризации агента. Через 24 ч удалить кожу на нижней части туловища (дистально по отношению к нижней части брюшной аорты лигирование) с использованием рассечение инструментов обновить 10% NBF, и помещают мышь обратно в контейнер в течение еще 4 дней при комнатной температуре.
- Проанализируйте контралатеральную и ишемической задние конечности, и поместить образцы в раствор муравьиной кислоты (Cal-Ex II) в течение 48 ч для облегчения декальцинации кости. Затем промыть образцов под проточной водой в течение 1 часа и вернуться к 10% NBF и заполните Faxitron (рентгеновская система, используемая для обеспечения кость декальцинировали) и микро-КТ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Анимация демонстрирует осмотического насоса и вставки хирургии ишемии задней конечности подробно описаны в протоколе. На рисунке 1 показана лазерного доплеровского изображения перфузии задней конечности, подтверждающие ишемию. После сосудистых литье с Microfil, 3D микро-КТ изображения сосудистой сети показывает, что Microfil может заполнить сосуды эффективно (рис. 2А), но это может произойти разрывы (рис. 2В) из-за различных процедурных факторов (например, пузырьки воздуха, отсутствие давление, вязкость Microfil).
Анимация Легенда
- Наведите в положении лежа и сделать надрез на спине в сторону позвоночника.
- Expose небольшой разрез назад.
- Наведите в лежачем положении и сделайте небольшой надрез выше колена у медиального бедра.
- Отделить кожу, подвергать сосудистой и вставьте оболочки трубы вверх в сторону туловища меморандумые задней разрез.
- Возьмем осмотического насоса и вставить катетер в оболочку трубки.
- Наведите в лежачем положении и направлять катетер вниз через шланг в разрез на бедре.
- Наведите в положении лежа и расположение насоса на спину и закрыть разрез.
- Наведите в лежачем положении и снимите оболочку трубы.
- Оттянуть кожу с втягивающим и использовать микрохирургических инструментов отделить вены от артерии. Дважды лигировать в бедренную артерию выше бедренной бифуркации с шва.
- Безопасный катетер к поверхностным ткани бедра.
- Закройте ног разрез шва.
Рисунок 1. Подтверждение ишемии задней конечности с помощью лазерного доплеровского томографа перфузии. Представитель доплеровского изображения шоW перфузии крови до и после хирургической перевязки бедренной артерии у мышей задних конечностей. Ишемия был создан в левой задней конечности (см. стрелки).
Рисунок 2. 3D Micro-CT образ задних конечностей сосудов. Сосудистые литье с Microfil раскрыть сеть вен и артерий в течение задних конечностей (A). Разрыв Microfil может также произойти (B), отключение визуализации подробного сосудистой сети (см. стрелки).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем метод осмотического наркотиков / доставки вещества в мышиной модели ишемии задней конечности. Кроме того, мы описываем техники литья, в котором мы использовали Microfil для получения 3D-реконструкции для анализа сосудистой сети.
Уровень или тяжесть ишемии изменяется в зависимости от где артериального лигирования / удаление сделан. Мы создали двойной лигирования в общей бедренной артерии проксимальнее происхождение Profunda бедра и epigastrica артерий, этот подход может привести к более тяжелой ишемии в дистальной задней конечности. Постоянно следите за животным после операции и обеспечить облегчение боли для местного применения анальгетиков. Кроме того, Microfil не всегда заливать конечностей сосудистой полностью. Таким образом, важно обеспечить, чтобы все кровь смывают сосудистой после перфузии гепаринизированной солевой раствор. Причины неполной перфузии Microfil включают отсутствиеpplied давление или неправильного вязкость Microfil, оба из которых должна быть достаточной для обеспечения Microfil достигает наиболее дистальных отделах задних конечностей и, таким образом заполняет всю сосудистой сети. Для решения этих проблем, применять постоянное давление при 100 мм ртутного столба и эксперимент с соединением: разбавителя отношений для конкретного применения животного.
Для изучения артериогенез (ранее существовавшего обеспечение артерии роста), идеальный подход для лигирования бедренную артерию непосредственно дистальнее происхождения бедренную ветвь перенаправить поток крови к коллатеральные сосуды. Тем не менее, ответ на эту процедуру меняется в широких пределах линий мышей, а также степень ишемии может быть недостаточным в некоторых линий мышей (например, C57BL / 6). Менее тяжелой ишемической модели не могут обеспечить длительный промежуток времени, чтобы исследовать терапевтический эффект в большой степени васкуляризации мышей, таких как мыши C57BL / 6. Чтобы избежать этих проблем, мы создали ишемии задней конечности BY лигирование проксимального отдела бедренной артерии, которая создала более тяжелой ишемии лучше продемонстрировать локальные эффекты высвобождения лекарственного средства, однако, такой подход исключает анализ артериогенеза в проксимальных глубоких сосудов обеспечения отрасли. Таким образом, терапевтические эффекты взяты преимущественно из дистального ишемический регионе, который согласуется с анатомической локализации (передне бедра), где препарат / вещество высвобождается. Во время операции, очень важно, чтобы не травмировать хрупкую бедренную вену, потому что местное кровотечение может привести к воспалению и отеку, которые влияют как артериогенеза и ангиогенез. Рекомендуется использовать 8-0 швов пролен для лигирования бедренной артерии с соответствующей узел галстука, чтобы избежать растяжения, деформации или разрыву артерии. Кроме того, Microfil должен быть использован немедленно (в течение 20 мин) после смешивания ингредиентов 3 (соединение, разбавитель и отвердитель), поскольку он быстро полимеризуется, что создает технические трудности для инъекций. Как ранее STATed, Microfil не всегда успешно заливать меньше сосудистой сети, но практика и использование соответствующих методов может помочь преодолеть это ограничение.
Объем заполнения насоса должна быть более 90% от среднего объема заполнения, если нет, дополнительный воздух может попасть в ловушку внутри насоса. Дополнительная техническая информация находится на www.alzet.com . Кроме того, Microfil агент должен быть предпочтительной вязкости для конкретного приложения, так что соотношение количества разбавителя для соединения возможно, должны быть изменены.
Задние конечности модели ишемии высокую воспроизводимость и применимо к PAD 10,11. Стабильной доставки терапевтических агентов в этой модели необходимо получить информативных результатов 2. В заключение отметим, что метод визуализации 3D мы использовали для визуализации морфологических структур является отличным инструментом для изучения сосудистой мыши и обеспечивает мощная система для studyiнг сосудистых патологий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют никакого конфликта интересов. Все животные процедуры были проведены в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC) при Техасском университете здоровья Научного центра в Хьюстоне.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Кейт Мишель из MD Anderson содействия малым изображениями животных за его техническую помощь с микро-КТ, Эдвард TH Yeh, MD, для хирургической помощи, и Ребекка Бартоу, доктор философии, за помощь в редактировании. Эта работа была выполнена при частичной поддержке Американской Ассоциации Сердца.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Surgical tools | Fine Science Tools | Type: Tool | |
| Puritan sterile cotton swabs | Fisher Scientific | 22-029-499 | Type: Tool |
| Betadine (povidone-iodine) | Fisher Scientific | 19-065534 | Type: Reagent |
| 70% Alcohol pads | Fisher Scientific | NC9926371 | Type: Reagent |
| Phosphate buffered saline | Lonza | 17-516F | Type: Reagent |
| 6-0 prolene suture | Cardinal Health | 8709 | Type: Tool |
| 8-0 prolene suture | Cardinal Health | 2775 | Type: Tool |
| Depilatory cream | Nair | Type: Tool | |
| Osmotic pump |  ALZET |
1002 | Type: Tool, 14 day release |
| Vinyl catheter | ALZET |
7760 | Type: Tool |
| Heparinized saline (0.9%) | Baxter | 2B0944 | Type: Reagent |
| Neutral buffered formalin | Richard-Allan Scientific | 5705 | Type: Reagent |
| Microfil (silicone rubber contrast agent) | Flowtech | MV-112 | Type Reagent, Microfil White |
| Cal-Ex II (formic acid solution) | Fisher Scientific | CS511-1D | Type: Reagent |
| Buprenex | CIII | 7571 | Type: Analgesic |
| Bupivicaine | Hospira, Inc. | 381 | Type: Analgesic |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Carl Zeiss Microimaging | Zeiss Stemi 2000-C | Type:Equipment |
| Laser Doppler perfusion imager | Perimed Inc. | Periscan PIM3 | Type:Equipment |
| Micro-CT imaging system | GE Healthcare | Explore Locus SP | Type:Equipment |
References
- Epstein, S. E., Fuchs, S., Zhou, Y. F., Baffour, R., Kornowski, R. Therapeutic interventions for enhancing collateral development by administration of growth factors: basic principles, early results and potential hazards. Cardiovasc. Res. 49, 532-542 (2001).
- Esaki, J., Marui, A., Tabata, Y., Komeda, M. Controlled release systems of angiogenic growth factors for cardiovascular diseases. Expert Opin. Drug Deliv. 4, 635-649 (2007).
- Bentley, M. D., Ortiz, M. C., Ritman, E. L., Romero, J. C. The use of microcomputed tomography to study microvasculature in small rodents. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 282, 1267-1279 (2002).
- Golomb, B. A., Dang, T. T., Criqui, M. H. Peripheral arterial disease: morbidity and mortality implications. Circulation. 114, 688-699 (2006).
- Hiatt, W. R. Pharmacologic therapy for peripheral arterial disease and claudication. J. Vasc. Surg. 36, 1283-1291 (2002).
- Hirsch, A. T., et al. Peripheral arterial disease detection, awareness, and treatment in primary care. JAMA. 286, 1317-1324 (2001).
- McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat. Med. 9, 713-725 (2003).
- Hirsch, A. T., et al. ACC/AHA Guidelines for the Management of Patients with Peripheral Arterial Disease (lower extremity, renal, mesenteric, and abdominal aortic): a collaborative report from the American Associations for Vascular Surgery/Society for Vascular Surgery, Society for Cardiovascular Angiography and Interventions, Society for Vascular Medicine and Biology, Society of Interventional Radiology, and the ACC/AHA Task Force on Practice Guidelines (writing committee to develop guidelines for the management of patients with peripheral arterial disease)--summary of recommendations. J. Vasc. Interv. Radiol. 17, 1383-1397 (2006).
- Zagorchev, L., Mulligan-Kehoe, M. J. Molecular imaging of vessels in mouse models of disease. Eur. J. Radiol. 70, 305-311 (2009).
- Losordo, D. W., Dimmeler, S. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines. Circulation. 109, 2487-2491 (2004).
- Waters, R. E., Terjung, R. L., Peters, K. G., Annex, B. H. Preclinical models of human peripheral arterial occlusive disease: implications for investigation of therapeutic agents. J. Appl. Physiol. 97, 773-780 (2004).
