Descrevemos a coleção de não fertilizado<em> Xenopus tropicalis</em> Ovos e produção de um extrato de ovo II-preso meiose. Este extracto de ovo pode ser utilizada para purificar a microtúbulos e RNAs microtúbulos associados.
Muitos organismos localizar mRNAs para destinos subcelulares específicas para a expressão do gene de controle espacial e temporalmente. Estudos recentes têm demonstrado que a maior parte do transcriptoma está localizada a uma posição não aleatória em células e de embriões. Uma abordagem para identificar mRNAs localizadas é purificar bioquimicamente uma estrutura celular de interesse e para identificar todos os transcritos associados. Usando tecnologias de sequenciamento de alto rendimento recentemente desenvolvidos agora é fácil identificar todos os RNAs associados com uma estrutura subcelular. Para facilitar a identificação do transcrito, é necessário trabalhar com um organismo com um genoma completamente sequenciado. Um sistema atractivo para a purificação bioquímica das estruturas celulares são extractos de ovos produzidos a partir da rã Xenopus laevis. No entanto, X. laevis atualmente não tem um genoma completamente seqüenciado, o que dificulta a identificação transcrição. Neste artigo descrevemos um métodopara a produção de extratos de ovos de um sapo relacionado, X. tropicalis, que tem um genoma completamente sequenciado. Nós fornecemos detalhes para a polimerização dos microtúbulos, purificação e isolamento transcrição. Embora este artigo descreve um método específico para a identificação dos transcritos associada aos microtúbulos, acreditamos que isso será facilmente aplicada a outras estruturas subcelulares e irá proporcionar um método poderoso para identificação de ARN localizadas.
Controle espacial e temporal da expressão do gene é importante para todas as células, e é especialmente importante para o controle do início embrionário tamborilar 1. Controlo espacial da expressão do gene é conseguida através da localização activa de mRNAs para destinos específicos dentro das células ou embriões. Em muitos tipos de células muito grandes, (por exemplo, oócitos, embriões, e neurónios) localização do mRNA é usada para restringir a expressão da proteína para o local de acção da proteína codificada. Uma vez que um ARNm localizada pode catalisar muitas rodadas de produção de proteína é mais eficiente para localizar um para localizar mRNA de moléculas individuais de proteínas. MRNAs localizados são tipicamente translationally reprimido até chegarem ao seu destino, o que serve para limitar ainda mais a localização da proteína codificada 2. Além dos muitos casos bem documentados de localização de RNA para controlar a modelagem embrionária, vários estudos têm demonstrado que os mRNAs são localizadospara o local de ação da proteína codificada. Exemplos importantes incluem a localização da β-actina e Arp2 3/3 4 mRNAs para o bordo de ataque da motilidade de fibroblastos e localização dos mRNAs para muitos reguladores de mitose e meiose para fusos mitóticos 5-7.
Muitos dos exemplos clássicos de mRNAs localizados foram identificados através de telas genéticos para mutações efeito materno e posteriormente foram determinados para codificar RNAs localizadas. No entanto, os últimos estudos do genoma começaram a fornecer uma visão mais ampla no âmbito da RNAs localizadas. Um recente na tela de hibridização in situ em embriões de Drosophila que demonstraram ~ 70% de todos os mRNAs têm uma localização específica, incluindo muitos novos destinos 8. A purificação do pseudopodia a partir de fibroblastos de rato identificado um grupo diverso de mRNAs localizada 9. Trabalhe a partir de nosso grupo usando purificação bioquímica dos microtúbulos de meiose Xenopus ovo extrai identificadas centenas de ARNm que copurify com o fuso de 5,7. O nosso trabalho mostrou que a maioria do ARNm de microtúbulos localizadas codificam proteínas que funcionam no controlo da mitose, apoiando a ideia de que os mRNAs estão localizadas no local de acção da proteína codificada. Além disso, a capacidade de detectar o enriquecimento em ARNm de uma fracção subcelular por purificação bioquímica destaca o poder desta abordagem para a identificação de mRNAs localizadas.
RNAs mais localizadas usar o transporte ativo no citoesqueleto, ou actina ou microtúbulos, para conseguir transporte para o seu destino final 10. Para obter uma melhor compreensão da extensão e tipo de RNAs que estão localizadas a destinos específicos utilizando uma abordagem bioquímica, é necessário dispor de um sistema in vitro que podem recapitular processos do citoesqueleto. Um dos sistemas principais para estudar a biologia do citoesqueleto é extractos de ovos produzidosa partir de ovos não fertilizados do sapo Xenopus laevis. X. laevis extratos de ovos têm sido utilizados há décadas para estudar uma grande variedade de processos do citoesqueleto e têm contribuído muito para a nossa compreensão dos mecanismos e moléculas que controlam a montagem do citoesqueleto e dinâmica 11. Além disso, X. laevis extratos de ovos são passíveis de purificação em larga escala de microtúbulos e proteínas associadas 12,13 e existem métodos bem desenhados para a produção de vários tipos de extratos de ovos 14-16. No entanto, para os estudos genómicos existem várias desvantagens para a utilização de X. laevis como um sistema modelo.
Durante décadas sapos Xenopus laevis foram um poderoso sistema para o estudo da biologia do desenvolvimento celular e, devido ao tamanho grande e de desenvolvimento de oócitos externa robusta 17. Além disso, o desenvolvimento de sistemas de extracto de ovos que podem recapitular muitos processe celulars em um tubo de ensaio fez este sapo um modelo experimental poderosa. No entanto, Xenopus laevis tem sido dificultada pela falta de um genoma completo, o qual foi retardado pela natureza alotetraplóide do contraste genome.In, uma espécie estreitamente relacionadas, Xenopus tropicalis, tem um genoma diplóide que foi sequenciado em 2010, 18. Enquanto X. tropicalis não é tratável como experimentalmente como X. laevis 17, a disponibilidade de um genoma sequenciado torna um sistema de modelo atractivo para realizar análises de genoma.
Neste relatório nós descrevemos um método para tornar-II, citostáticos extratos fator de presos meiose (CSF) de X. tropicalis 19. Em seguida, descrevemos um método simples para purificar microtúbulos e RNAs associados a partir deste extrato. Os RNAs pode então ser convertido em bibliotecas passíveis de sequenciação utilizando tecnologias de sequenciação de alto rendimento recentemente desenvolvidos. Uma vez que as bibliotecassão sequenciadas podem ser alinhados com o genoma da rã para identificar mRNAs específicos que são enriquecidas na amostra em relação ao extracto de microtúbulos total. Isto fornece um método poderoso para detectar a localização mRNA microtúbulos-alvo em uma escala de todo o genoma. Além de ser capaz de detectar ARNm localizadas, a utilização de sequenciação de alto rendimento e um genoma sequenciado oferecem a possibilidade de descobrir novos transcritos que não estão presentes na base de dados pública de anotações.
Neste relatório nós descrevemos um método simples para a produção de extratos de ovos CSF-presos de X. tropicalis, 19, e utilizar este extracto para estudar RNAs microtúbulos associados 7. O procedimento básico para a produção de extratos de ovos CSF-presos de X. tropicalis, é o mesmo que o utilizado para X. laevis com algumas diferenças fundamentais. Um dos aspectos mais difíceis de trabalhar com X. tropicalis sapos é a obtenção de ovos de alta qualidade o suficiente para fazer um extrato com a nucleação de microtúbulos ou atividade de montagem do fuso comparável ao X. extrai laevis ovo. Para alcançar melhores condições de postura de ovos, evitando o deslizamento de meiose II parada do ciclo celular, o intervalo entre as injeções de hormônio para X. tropicalis, é mais curto do que o utilizado para X. laevis, e a temporização com a terceira injecção de hCG para o início da postura de ovos é também muito menor. Com X. laevis o momento da injecção de hCG tele início da postura de ovos é tal que é conveniente e eficiente para os ovos a serem definidos durante a noite em buffer. No entanto, devido ao curto tempo entre a injecção de hCG e a postura de ovos com X. Tropicalis é frequentemente necessário para expressar manualmente os ovos de rãs. Outra diferença significativa entre fazer extrato de ovo dos dois sapos diferentes é o passo dejellying. Com X. laevis os ovos são tão grandes que é fácil de determinar quando o casaco geléia tenha dissolvido por observar de perto como os ovos são espaçados no copo. Como a reação dejellying começa, os ovos começam a se arrumar mais densamente. No entanto, X. tropicalis ovos são muito menores e que pode ser bastante difícil de determinar quando o revestimento de gelatina é dissolvido pela ovo densidade de empacotamento sozinho. Verificou-se que o método mais fiável para determinar quando o revestimento de gelatina é dissolvida é monitorizar a orientação do animal (preto) e vegetais (branco) pólos. Quando todo o vegetal pólos Orient para a parte inferior do recipiente o revestimento geleia foi removida suficiente para prosseguir com o extracto. Finalmente, enquanto X. extracto de ovo laevis podem ser armazenados a temperaturas baixas (4-12 ° C), observou-se que é crítico para manter X. extracto de ovo tropicalis, à temperatura ambiente (20-25 ° C) durante a preparação e manipulações experimentais para preservar a actividade bioquímica. Por causa das diferenças na facilidade de utilização é preferível utilizar X. laevis rãs para a produção de extrato de ovo. No entanto, para as experiências que requerem ou são facilitadas por um organismo com um genoma sequenciado, X. tropicalis é um excelente sistema alternativo.
O método que descrevemos neste relatório utiliza taxol como um agente de estabilização dos microtúbulos para induzir a polimerização dos microtúbulos. Nós escolhemos este método porque o taxol é um agente de estabilização de microtúbulos robusto que facilita o isolamento em larga escala de microtúbulos purificada. O método them que descrevemos poderia provavelmente ser melhorada por meio da comparação das proteínas e RNAs microtúbulos associados, utilizando métodos alternativos de polimerização de microtúbulos. Alternativas poderiam incluir polimerização usando polimerização GTP induzida (técnica clássica), 22 ou usando Ran-GTP como polymerizer microtúbulos para imitar os microtúbulos induzidas pelo conjunto do eixo da cromatina-driven 23. Finalmente, a utilização de núcleos de esperma purificado para induzir a polimerização dos microtúbulos seria o mais próximo imitar aos tipos de microtúbulos, que são nucleados durante a mitose (centrossoma, a cromatina, e cinetocoro mediada). Inconvenientes para estas fontes alternativas de nucleação de microtúbulos são os agentes de nucleação que não são tão facilmente disponíveis como o taxol e eles não nucleada ou estabilizar microtúbulos tão eficientemente como o taxol. Assim, cada um destes métodos seria mais difícil de utilizar para purificações em grande escala. A vantagem de se comparar vários tipos diferentes de nucleadores de microtúbulosé que poderia ser possível identificar as proteínas e / ou RNAs que são específicos para cada via de nucleação de microtúbulos.
O método que descrevemos aqui aproveita extractos citoplasmáticos de anfíbios. No entanto, esta abordagem poderia ser estendida para o uso do sistema de extracto de outros organismos. Extractos mitóticas foram descritos a partir de células de cultura de tecidos humanos sincronizados 24 que fielmente recapitular muitos aspectos da montagem de microtúbulos. Nós utilizamos com sucesso estes extractos identificar ARN associada a microtúbulos a partir de células HeLa 5. Similar esquemas de purificação de microtúbulos têm sido descritas por muitos organismos diferentes 25,26, embora os RNAs dos microtúbulos associados ainda não foram examinados. A abordagem aqui descrita pode ser usada com qualquer organismo que pode produzir um extracto citoplasmático concentrada capaz de nucleação microtúbulos.
Finalmente, embora a abordagem que deescriba discute aqui a purificação de microtúbulos e proteínas e RNAs associados, esta abordagem pode ser generalizada a outras estruturas subcelulares. Enquanto mRNAs mais localizadas não tenham sido identificados utilizando os métodos bioquímicos recentes avanços em tecnologias de sequenciação de DNA e RNA que esta abordagem seja um método atraente para identificar ARN localizadas. Nesta abordagem, qualquer estrutura subcelular ou sub-embrião de interesse pode ser isolado ou purificado. Em seguida, as proteínas e RNAs associados podem ser identificados em grande escala do genoma. RNAs pode então ser comparado com o teor de ANR das células totais ou embrião para identificar ARN localizadas enriquecidos. Esta abordagem poderia ser usada com os ovos inteiros (animal e vegetal separação, semelhante à abordagem que identificou os primeiros RNAs localizadas em Xenopus 27), actina RNAs associados, RNAs ER-associados, RNAs mitocôndrias associadas, ou a qualquer estrutura subcelular que pode ser purificado com RNAs associados intactas. Baseadonosso trabalho em RNA associada aos microtúbulos podemos prever que este seria um excelente método para descobrir novas proteínas que funcionam em um determinado local. Além disso, a identificação da localização e extensão de todos os RNAs localizadas irá fornecer insights sobre como as células e embriões usar localização mRNA para controlar a expressão de genes.
The authors have nothing to disclose.
REAGENTS | |||
Xenopus tropicalis | NASCO | LM00823MX | |
human Chorionic Gonadotropin | Sigma-Aldrich | CG10 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C8106 | |
sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Leupeptin | Sigma-Aldrich | L9783 | |
Pepstatin | Sigma-Aldrich | P5318 | |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 | |
Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
Gelatin, porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
Taxol | Sigma-Aldrich | T7191 | |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
L-Cysteine, free base | USB Corporation | 14030 | |
Cichlid Lake Salt | Seachem | 47894 | |
Marine salt | Seachem | SC7111 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
EQUIPMENT | |||
1 ml syringes | BD Biosciences | 309659 | |
18 gauge needles | BD Biosciences | 305195 | |
30 gauge needles | BD Biosciences | 305106 | |
Rubbermaid Plastic bucket | Amazon | 6306 | |
Beckman Polyallomer 2 x ½ inch Ultracentrifuge tubes | Beckman | 326819 | |
15 ml round-bottomed glass centrifuge tubes | Fisher Scientific | 45500-15 | |
Rubber adapter sleeves for 15 ml tubes | Kimble-Chase | 45550-15 | |
5 ¾ inch glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
14 ml polypropylene round-bottom tube | BD Biosciences | 352059 | |
Sorvall HB-6 rotor | Thermo Scientific | 11860 | |
Sorvall RC-6 centrifuge | Thermo Scientific | 46910 |