Vi beskriver indsamlingen af ubefrugtede<em> Xenopus tropicalis</em> Æg og produktion af en meiose II anholdt æggeekstrakt. Denne æggeekstrakt kan anvendes til at oprense mikrotubuli og mikrotubulus-associerede RNA'er.
Mange organismer lokalisere mRNA til specifikke subcellulære omgivelser rumligt og tidsligt kontrol genekspression. Nylige undersøgelser har vist, at størstedelen af transkriptomet er lokaliseret til en tilfældig position i celler og embryoer. En metode til at identificere lokaliserede mRNA er at biokemisk rense en cellestruktur af interesse og for at identificere alle tilhørende udskrifter. Brug af nyligt udviklede high-throughput sekventering teknologier er det nu ligetil at identificere alle RNA'er associeret med en subcellulær struktur. For at lette udskrift identifikation er det nødvendigt at arbejde med en organisme med en fuldt sekventeret genom. Én attraktivt system til biokemisk oprensning af subcellulære strukturer er æg uddrag fremstillet frøen Xenopus laevis. Men X. laevis øjeblikket ikke har et fuldstændigt genom, hvilket hæmmer udskrift identifikation. I denne artikel beskriver vi en metodetil at producere æg uddrag fra en beslægtet frø, X. tropicalis, der har et fuldt sekventeret genom. Vi leverer oplysninger til mikrotubuli polymerisation, rensning og udskrift isolation. Mens denne artikel beskrives en specifik metode til identifikation af mikrotubuli-associerede udskrifter, mener vi, at det vil være let anvendes på andre subcellulære strukturer og vil give en kraftfuld metode til identifikation af lokaliserede RNA'er.
Rumlig og tidsmæssig kontrol af genekspression er vigtig for alle celler, og er specielt vigtigt for kontrol af tidlige embryonale pattering 1. Spatial kontrol af genekspression opnås gennem aktiv lokalisering af mRNA til bestemte destinationer inden celler eller embryoner. I mange meget store celletyper mRNA lokalisering (f.eks oocytter, embryoner, og neuroner) anvendes til at begrænse proteinekspression til virkningsstedet af det kodede protein. Da en lokaliseret mRNA kan katalysere mange runder af proteinproduktion det er mere effektivt at lokalisere et mRNA end at lokalisere individuelle proteinmolekyler. Lokaliserede mRNA er typisk translationally undertrykt, indtil de når deres bestemmelsessted, som tjener til yderligere at begrænse lokalisering af kodede protein 2. Ud over de mange veldokumenterede tilfælde af RNA lokalisering at kontrollere embryonale mønster, har flere undersøgelser dokumenterede mRNA'er der er lokaliserettil stedet for virkningen af det kodede protein. Fremtrædende eksempler indbefatter lokalisering af β-actin-3 og Arp2 / 3 4 mRNA'er til forkanten af bevægelige fibroblaster og lokalisering af mRNA'erne for mange mitotiske regulatorer til meiotiske og mitotiske spindler 5-7.
Mange af de klassiske eksempler på lokaliserede mRNAer blev identificeret gennem genetiske skærme til maternelle effekt mutationer og blev senere besluttet at indkode lokaliserede RNA. Imidlertid har de seneste genom-dækkende undersøgelser er begyndt at give bredere indblik i omfanget af lokaliserede RNA'er. En nylig in situ hybridisering skærm i Drosophila embryoer viste, at ~ 70% af alle mRNA'er har en specifik lokalisering, herunder mange nye destinationer 8.. Oprensning af pseudopodia fra musefibroblaster identificeret en forskelligartet gruppe af lokaliserede mRNA 9.. Arbejde fra vores gruppe ved hjælp biokemisk oprensning af mikrotubuli fra meiotic Xenopus æg udvinder identificeret hundredvis af mRNA, der copurify med spindelen 5,7. Vores arbejde viste, at hovedparten af mikrotubulus-lokaliserede mRNA'er koder for proteiner, der fungerer i kontrol i mitosen, støtter tanken om, at mRNA'er er lokaliseret til stedet for virkningen af det kodede protein. Desuden evnen til at detektere mRNA berigelse i en subcellulær fraktion ved biokemisk oprensning fremhæver kraften af denne fremgangsmåde til identifikation af lokaliserede mRNA'er.
De fleste lokaliserede RNA bruger aktiv transport på cytoskelettet enten actin eller mikrotubuli, for at opnå transport til deres endelige bestemmelsessted 10.. For at få en bedre forståelse af omfanget og typer af RNA, der er lokaliseret til bestemte destinationer via en biokemisk tilgang er det nødvendigt at have et in vitro system, der kan rekapitulere cytoskeletale processer. En af de førende systemer til at studere cytoskeletal biologi er æg produceret uddragfra ubefrugtede æg fra frøen Xenopus laevis. X. laevis æg ekstrakter har været brugt i årtier for at studere en bred vifte af cytoskeletale processer og har bidraget meget til vores forståelse af de mekanismer og molekyler, der styrer cytoskeletal montage og dynamik 11.. Desuden X. laevis æg ekstrakter er egnede til store oprensninger af mikrotubuli og tilhørende proteiner 12,13 og der er veldesignede metoder til produktion af forskellige typer af æg ekstrakter 14-16. Men for genomiske undersøgelser er der flere ulemper ved anvendelse af X. laevis som et modelsystem.
I årtier Xenopus laevis frøer har været et kraftfuldt system til undersøgelse af udviklingstoksicitet og cellebiologi, på grund af den store oocyte størrelse og robust ydre udvikling 17.. Desuden har opbygningen af æggeekstrakt systemer, der kan rekapitulere mange cellulære processes i et reagensglas har gjort denne frøen en kraftig eksperimentel model. Imidlertid har Xenopus laevis været hæmmet af manglen på en fuldstændig genomsekvens, som er blevet bremset af den allotetraploid karakter genome.In kontrast et nært beslægtet art, Xenopus tropicalis, har en diploid genom, der blev sekventeret i 2010 18. Mens X. tropicalis er ikke så eksperimentelt medgørlig som X. laevis 17 tilgængeligheden af en genom gør det til et attraktivt modelsystem til at udføre genom analyser.
I denne rapport beskriver vi en metode til at gøre meiose II, cytostatika factor-anholdte ekstrakter (CSF) fra X. tropicalis 19.. Vi derefter beskrive en simpel metode til at rense mikrotubuli og tilhørende RNA'er fra dette ekstrakt. RNA'erne kan derefter omdannes til bibliotekerne kan underkastes sekventering hjælp nyligt udviklede high throughput sekventering teknologier. Når bibliotekernesekventeres de kan justeres til genomet af frøen at identificere specifikke mRNA'er, som er beriget i mikrotubulus prøve forhold til den samlede ekstrakt. Dette giver en stærk metode til at opdage mikrotubuli målrettet mRNA lokalisering på et genom-plan. Ud over at være i stand til at detektere lokaliserede mRNA'er, tilbyde brug af high-throughput sekventering og et genom muligheden for at opdage nye transkripter, der ikke i øjeblikket til stede i offentlige database anmærkninger.
I denne rapport har vi beskrevet en enkel metode til at producere CSF-anholdte æg uddrag X. tropicalis 19 og bruge dette ekstrakt til at studere mikrotubuli-associerede RNA 7.. Den grundlæggende procedure for at producere CSF-anholdt æg uddrag fra X. tropicalis er den samme som anvendt for X. laevis med et par vigtige forskelle. Et af de mest udfordrende aspekter at arbejde med X. tropicalis frøer er at opnå tilstrækkelig høj kvalitet æg til at gøre en ekstrakt med mikrotubuli nukleering eller spindel samling aktivitet sammenlignelig med X. laevis æg ekstrakter. For at opnå optimale æglæggende betingelser samtidig forhindre afvigelser fra meiose II cellecyklusstop, bliver intervallet mellem hormonindsprøjtninger for X. tropicalis er kortere end den, der anvendes for X. laevis, og timingen af den tredje hCG injektion til begyndelsen af æglægningen er også meget kortere. Med X. laevis timingen fra hCG injektionen til than begyndelsen af æglægningen er sådan, at det er praktisk og effektivt for æg, der skal fastsættes natten ind i buffer. Men på grund af den kortere tid mellem hCG injektion og æglægning med X. Tropicalis det er ofte nødvendigt manuelt udtrykke æg fra frøer. En anden væsentlig forskel mellem at gøre æg uddrag af to forskellige frøer er dejellying skridt. Med X. laevis æggene er så store, at det er let at bestemme, hvornår jelly lag er opløst ved at observere, hvor tæt æggene er fordelt i bægerglasset. Som dejellying reaktion påbegyndes, æggene begynder at pakke mere tæt. Men X. tropicalis æg er meget mindre, og det kan være ganske svært at afgøre, hvornår jelly lag er opløst ved ægpakkeri tæthed alene. Vi har fundet, at den mest pålidelige metode til at bestemme, hvornår gelé lag er opløst, er at overvåge orienteringen af dyr (sort) og vegetabilsk (hvid) poler. Når alle vegetative poler orient mod bunden af bægerglasset jelly lag er blevet fjernet nok til at fortsætte med ekstraktet. Endelig mens X. laevis æggeekstrakt kan opbevares ved kølige temperaturer (4-12 ° C) har vi observeret, at det er afgørende at fastholde X. tropicalis æggeekstrakt ved stuetemperatur (20-25 ° C) under forberedelse og eksperimentelle manipulationer for at bevare biokemisk aktivitet. På grund af forskellene i brugervenlighed, vi foretrækker at bruge X. laevis frøer til produktion af æg ekstrakt. Men for eksperimenter, der kræver eller lettes af en organisme med en genom, X. tropicalis er et glimrende alternativ system.
Den metode, som vi har beskrevet i denne rapport anvendt taxol som en mikrotubulus-stabiliserende middel til at inducere mikrotubuli polymerisation. Vi valgte denne metode, fordi taxol er en robust mikrotubulus-stabiliserende middel, der letter storstilet isolering af oprensede mikrotubuli. Fremgangsmåden thved vi beskrev kunne sandsynligvis forbedres ved at sammenligne proteiner og RNA'er associeret med mikrotubuli anvender alternative mikrotubuli polymerisationsmetoder. Alternativer kunne omfatte polymerisation under anvendelse GTP-induceret polymerisation (en klassisk teknik), 22 eller ved hjælp af Ran-GTP som en mikrotubulus polymerizer at efterligne mikrotubuli induceret af kromatin-drevet spindel samling 23. Endelig anvendelse af oprenset sæd kerner at inducere mikrotubuli polymerisation ville være det tætteste efterligner på de typer af mikrotubuli, der er kerneholdige under mitosen (centrosome, chromatin og kinetochore medieret). Ulemper til disse alternative kilder til mikrotubuli nukleering er, at de nukleeringsmidler ikke er så let tilgængelig som taxol og de ikke nucleate eller stabilisere mikrotubuli så effektivt som taxol. Derfor ville hver af disse metoder være sværere at bruge til oprensninger i stor skala. Fordelen ved at sammenligne flere forskellige typer af mikrotubuli kimdannelsesmidlerer, at det kunne være muligt at identificere proteiner og / eller RNA'er, der er specifikke for hver vej af mikrotubuli nukleering.
Den metode, som vi har beskrevet her drager fordel af cytoplasmatiske ekstrakter af padder. Imidlertid kan denne fremgangsmåde udvides til brugen af ekstraktet system fra andre organismer. Mitotiske uddrag er beskrevet fra synkroniserede humane vævskulturceller 24 at trofast rekapitulere mange aspekter af mikrotubuli. Vi har med succes brugt disse ekstrakter til at identificere mikrotubuli-associerede RNA fra HeLa-celler 5. Lignende mikrotubuli oprensningsskemaer er blevet beskrevet til mange forskellige organismer 25,26, selvom mikrotubuli forbundet RNA'er ikke er blevet undersøgt. Den fremgangsmåde der er beskrevet her, kan anvendes sammen med enhver organisme, der kan producere en koncentreret cytoplasmatisk ekstrakt kan kimdannende mikrotubuli.
Endelig, selv om den tilgang, at vi deskriftklog her diskuterer rensning af mikrotubuli og tilhørende proteiner og RNA'er, kan denne fremgangsmåde være generaliseres til andre subcellulære strukturer. Mens de fleste lokaliserede mRNA ikke er blevet identificeret ved hjælp af biokemiske metoder de seneste fremskridt i DNA-og RNA-sekventering teknologier gør denne tilgang til en attraktiv metode til at identificere lokaliserede RNA. I denne tilgang enhver subcellulært eller sub-embryo struktur af renter kan isoleres eller oprenses. Så de tilknyttede proteiner og RNA'er kan identificeres på et genom bred skala. RNA'er kan derefter sammenlignes til RNA indholdet af den samlede celle eller embryo at identificere beriget lokaliserede RNA'er. Denne fremgangsmåde kan bruges med hele æg (animalsk og vegetabilsk separation, svarende til den tilgang, identificerede de første lokaliserede RNA i Xenopus 27), actin tilknyttede RNA'er, ER-associerede RNA'er, mitokondrier-associerede RNA'er, eller nogen subcellulære struktur, der kan oprenses med tilhørende RNA'er intakte. Baseret påvores arbejde med mikrotubuli-associeret RNA forudser vi, at dette ville være en fremragende metode til at opdage nye proteiner, der fungerer på en given lokalitet. Desuden vil identifikation af placeringen og omfanget af alle lokaliserede RNA give indsigt i, hvordan celler og embryoer bruge mRNA lokalisering til at styre genekspression.
The authors have nothing to disclose.
REAGENTS | |||
Xenopus tropicalis | NASCO | LM00823MX | |
human Chorionic Gonadotropin | Sigma-Aldrich | CG10 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C8106 | |
sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Leupeptin | Sigma-Aldrich | L9783 | |
Pepstatin | Sigma-Aldrich | P5318 | |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 | |
Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
Gelatin, porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
Taxol | Sigma-Aldrich | T7191 | |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
L-Cysteine, free base | USB Corporation | 14030 | |
Cichlid Lake Salt | Seachem | 47894 | |
Marine salt | Seachem | SC7111 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
EQUIPMENT | |||
1 ml syringes | BD Biosciences | 309659 | |
18 gauge needles | BD Biosciences | 305195 | |
30 gauge needles | BD Biosciences | 305106 | |
Rubbermaid Plastic bucket | Amazon | 6306 | |
Beckman Polyallomer 2 x ½ inch Ultracentrifuge tubes | Beckman | 326819 | |
15 ml round-bottomed glass centrifuge tubes | Fisher Scientific | 45500-15 | |
Rubber adapter sleeves for 15 ml tubes | Kimble-Chase | 45550-15 | |
5 ¾ inch glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
14 ml polypropylene round-bottom tube | BD Biosciences | 352059 | |
Sorvall HB-6 rotor | Thermo Scientific | 11860 | |
Sorvall RC-6 centrifuge | Thermo Scientific | 46910 |