We beschrijven de collectie van onbevruchte<em> Xenopus tropicalis</em> Eieren en productie van een meiose II-gearresteerd ei-extract. Dit ei extract kan worden gebruikt voor microtubules en microtubule-geassocieerde RNAs zuiveren.
Veel organismen lokaliseren mRNA om specifieke subcellulaire bestemmingen aan ruimte en tijd controle genexpressie. Recente studies hebben aangetoond dat de meerderheid van de transcriptoom is gelokaliseerd op een niet-willekeurige positie in cellen en embryo's. Een benadering om gelokaliseerde mRNA's te identificeren is om biochemisch zuiveren een cellulaire structuur van de rente en alle bijbehorende transcripties identificeren. Met behulp van recent ontwikkelde high-throughput sequencing technieken is het nu eenvoudig om alle RNA's in verband met een subcellulaire structuur te identificeren. Om transcript identificatie te vergemakkelijken is het noodzakelijk om te werken met een organisme met een volledig gesequenced genoom. Een aantrekkelijk systeem voor de biochemische zuivering van subcellulaire structuren zijn ei uittreksels uit de kikker Xenopus laevis. Echter, X. laevis heeft momenteel geen een volledig gesequenced genoom, waarvan transcript identificatie belemmert. In dit artikel beschrijven we een werkwijzevoor ei uittreksels uit een verwante kikker, X. tropicalis, dat een volledig gesequenced genoom. Wij bieden informatie voor microtubuli polymerisatie, zuivering en transcript isolement. Hoewel dit artikel beschrijft een specifieke werkwijze voor identificatie van microtubule-geassocieerde transcripten, geloven wij dat het gemakkelijk kan worden toegepast op andere subcellulaire structuren en een krachtige techniek voor de identificatie van gelokaliseerde RNA's.
Ruimtelijke en temporele regulatie van genexpressie is van belang voor alle cellen, en is vooral belangrijk voor de controle van de vroege embryonale kletteren 1. Ruimtelijke regulatie van genexpressie wordt bereikt door de actieve lokalisatie van mRNA naar specifieke bestemmingen binnen cellen of embryo. In vele zeer grote celtypen (bijv. oöcyten, embryo's en neuronen) mRNA lokalisatie wordt gebruikt voor eiwitexpressie de plaats van werking van het gecodeerde eiwit te beperken. Aangezien een gelokaliseerde mRNA vele rondes van eiwitproductie kan katalyseren is efficiënter om een mRNA lokaliseren op afzonderlijke eiwitmoleculen lokaliseren. Gelokaliseerde mRNA's gewoonlijk translatie onderdrukt totdat ze hun bestemming, dat dient om de lokalisatie van het gecodeerde eiwit 2 verder te beperken bereiken. Naast de vele goed gedocumenteerde gevallen van RNA lokalisatie embryonale patroonvorming beheersen, hebben verschillende studies gedocumenteerd mRNAs die gelocaliseerdop de plaats van werking van het gecodeerde eiwit. Prominente voorbeelden zijn lokalisatie van de β-actine en Arp2 3/3 4 mRNAs de voorrand beweeglijke fibroblasten en lokalisatie van de mRNAs voor veel mitotische regelgevers meiose en mitose spindels 5-7.
Veel van de klassieke voorbeelden van gelokaliseerde mRNA's werden geïdentificeerd door middel van genetische screens voor maternale effect mutaties en werden later bepaald om gelokaliseerde RNA's coderen. Echter, recente genoom-brede studies begonnen om breder inzicht te geven in de omvang van gelokaliseerde RNA's. Een recent in situ hybridisatie gebruik in Drosophila embryo's aangetoond dat ~ 70% van alle mRNAs een specifieke lokalisatie, waaronder vele nieuwe bestemmingen 8. Zuivering van pseudopodia uit muizen fibroblasten die een diverse groep van gelokaliseerde mRNA 9. Werken vanuit onze groep met biochemische zuivering van microtubuli uit meiose Xenopus ei extracten die honderden mRNAs die copurify de as 5,7. Ons werk toonde aan dat de meerderheid van microtubule-gelokaliseerde mRNA's coderen voor eiwitten die functioneren in de controle van de mitose, hetgeen het idee ondersteunt dat mRNA's gelokaliseerd op de plaats van werking van het gecodeerde eiwit. Bovendien is de mogelijkheid om mRNA invloeden te onderscheiden in een subcellulaire fractie die door biochemische zuivering benadrukt de kracht van deze benadering voor de identificatie van gelokaliseerde mRNA.
De meeste gelokaliseerde RNA's gebruiken actief transport op het cytoskelet, hetzij actine of microtubuli, om het vervoer te komen naar hun eindbestemming 10. Om een beter begrip van de omvang en de aard van RNAs die zijn gelokaliseerd aan specifieke bestemmingen met een biochemische benadering moet een hebben in vitro systeem dat cytoskelet processen recapituleren krijgen. Een van de belangrijkste systemen voor het bestuderen van het cytoskelet biologie is ei extracten geproduceerduit onbevruchte eieren van de kikker Xenopus laevis. X. laevis ei extracten zijn gebruikt voor decennia om een breed scala van cytoskelet processen te bestuderen en hebben veel bijgedragen aan ons begrip van de mechanismen en moleculen die cytoskelet assemblage en dynamiek 11 beheersen. Voorts X. laevis ei extracten vatbaar zijn voor grootschalige zuiveringen van microtubuli geassocieerde eiwitten en 12,13 en zijn goed ontworpen werkwijzen voor de productie van verschillende soorten ei extracten 14-16. Voor genomische studies er verschillende nadelen aan het gebruik van X. laevis als modelsysteem.
Al decennia Xenopus laevis kikkers hebben een krachtig systeem voor de studie van de ontwikkelingsbiologie en celbiologie, gezien het grote eicel omvang en robuuste externe ontwikkeling 17 geweest. Bovendien is de ontwikkeling van ei extract systemen vele cellulaire processe kunnen recapitulerens in een reageerbuis heeft deze kikker heeft een krachtig experimenteel model. Echter, Xenopus laevis gehinderd door het ontbreken van een genomische sequentie, die is vertraagd door de aard van de allotetraploid genome.In contrast, een nauw verwante soorten, Xenopus tropicalis, een diploïd genoom die werd gesequenced 2010 18. Terwijl X. tropicalis is niet zo experimenteel handelbaar als X. laevis 17 van de beschikbaarheid van een gesequenced genoom maakt het een aantrekkelijk model systeem om het gehele genoom analyses uit te voeren.
In dit rapport beschrijven we een methode om meiose II-, cytostatica factor-gearresteerd extracten (CSF) te maken van X. tropicalis 19. Daarna beschrijven we een eenvoudige methode om microtubuli en bijbehorende RNA te zuiveren van dit extract. Het RNA kan vervolgens worden omgezet in bibliotheken vatbaar voor sequencing met behulp van recent ontwikkelde high throughput sequencing technologieën. Zodra de bibliothekenzijn sequentie kunnen worden aangepast aan het genoom van de kikker specifieke mRNAs die verrijkt in de microtubule monster vergeleken droge stof identificeren. Dit zorgt voor een krachtige methode om microtubuli-gerichte mRNA lokalisatie te detecteren op een genoom-brede schaal. Naast de mogelijkheid om gelokaliseerde mRNA te detecteren, het gebruik van high-throughput sequencing en gesequenced genoom bieden de mogelijkheid van het ontdekken van nieuwe transcripten die momenteel aanwezig zijn in openbare databank annotaties.
In dit rapport hebben we een eenvoudige methode beschreven om CSF-gearresteerd ei uittreksels uit X. tropicalis 19 en het gebruik van dit extract aan microtubuli geassocieerde RNA's te bestuderen 7. De basisprocedure voor het produceren van CSF-gearresteerd ei uittreksels uit X. tropicalis is hetzelfde als voor X. laevis met een paar belangrijke verschillen. Een van de meest uitdagende aspecten aan het werken met X. tropicalis kikkers is het verkrijgen van voldoende hoge kwaliteit eieren om een uittreksel te maken met microtubuli nucleatie of spilstelsel activiteit vergelijkbaar met X. laevis ei haalt. Om optimale eileg voorwaarden te bereiken, terwijl het voorkomen slippen van meiose II celcyclus, het interval tussen hormoon injecties voor X. tropicalis korter zijn dan voor X. laevis en de timing van de derde hCG injectie aan het begin van eileggen is veel korter. Met X. Laevis de timing van de hCG injectie aan thij begin eileggen is zodanig dat het handig en efficiënt voor eieren nachts worden gelegd in buffer. Vanwege de korte tijd tussen hCG injectie en eieren leggen met X. tropicalis is het vaak noodzakelijk om de eieren van kikkers handmatig drukken. Een ander significant verschil tussen het maken ei extract uit de twee verschillende kikkers is dejellying stap. Met X. laevis de eieren zo groot dat het gemakkelijk is te bepalen wanneer het gelei coat door observeren hoe nauw de eieren zijn verdeeld in het bekerglas opgelost. Zoals de dejellying reactie aanvangt, de eieren beginnen te dichter pakken. Echter, X. tropicalis eieren zijn veel kleiner en het kan heel moeilijk zijn om te bepalen wanneer de gelei coat door ei pakkingdichtheid alleen al heeft opgelost. Wij hebben gevonden dat de meest betrouwbare methode om te bepalen wanneer de gelei laag opgelost is de oriëntatie van het dier (zwart) en plantaardig (wit) polen controleren. Wanneer alle plantaardige polen orient naar de bodem van het bekerglas de gelei laag is verwijderd genoeg te gaan met het extract. Tot slot, terwijl X. laevis ei-extract kan bij koele temperaturen worden opgeslagen (4-12 ° C) hebben wij geconstateerd dat het cruciaal is om X. behouden tropicalis ei extract bij kamertemperatuur (20-25 ° C) tijdens de bereiding en experimentele manipulaties biochemische activiteit behouden. Vanwege de verschillen in gebruiksgemak wij bij voorkeur X te laevis kikkers voor de productie van ei extract. Echter, voor de experimenten die vereisen of worden vergemakkelijkt door een organisme met een gesequenced genoom, X. tropicalis is een uitstekend alternatief systeem.
De methode die we in dit rapport zijn beschreven maakt gebruik van taxol als microtubuli-stabiliserende agent om microtubuli polymerisatie veroorzaken. We kozen deze methode omdat taxol is een robuuste microtubule-stabiliserende middel dat de grootschalige isolatie van gezuiverd microtubules vergemakkelijkt. Werkwijze thten we beschreven kunnen waarschijnlijk worden verbeterd door de eiwitten en RNAs verbonden microtubules alternatieve microtubuluspolymerisatie methoden vergelijken. Alternatieven kunnen onder polymerisatie met GTP-geïnduceerde polymerisatie (een klassieke techniek), 22 of met behulp van Ran-GTP als een microtubule polymerisator aan de microtubuli veroorzaakt door chromatine-driven spilstelsel 23 na te bootsen. Gebruik tenslotte gezuiverd spermakernen te induceren microtubuluspolymerisatie zou het dichtst bootsen de typen microtubuli die gekiemd tijdens de mitose (centrosome, chromatine en kinetochore gemedieerde). Nadelen van deze alternatieve microtubule kiemvorming zijn dat de kiemvormende middelen niet zo gemakkelijk verkrijgbaar als taxol en zij niet kiemen of stabiliseren microtubuli efficiënt taxol. Derhalve elk van deze methoden echter moeilijk te gebruiken voor grootschalige zuiveringen zijn. Het voordeel van het vergelijken van meerdere verschillende microtubule kiemvormendeis dat het mogelijk zou kunnen zijn om eiwitten en / of RNA's die specifiek zijn voor elke route van microtubule nucleatie identificeren.
De methode die we hier hebben beschreven maakt gebruik van cytoplasmatische extracten van amfibieën. Echter, deze benadering kan worden uitgebreid naar het gebruik van extractiesysteem van andere organismen. Mitotische extracten werden beschreven van gesynchroniseerde menselijke weefselkweek cellen 24 die trouw recapituleren veel aspecten van de assemblage van microtubuli. We hebben met succes gebruik gemaakt van deze extracten om microtubuli geassocieerde RNA's te identificeren uit HeLa-cellen 5. Soortgelijke microtubule zuiveringsschema's zijn beschreven voor verschillende organismen 25,26, hoewel het microtubule geassocieerde RNAs niet onderzocht. De hier beschreven benadering kan worden gebruikt met een organisme dat een geconcentreerde cytoplasmatisch extract kan kiemvormende microtubules kan produceren.
Tenslotte, hoewel de aanpak die we deschrijver hier bespreekt de zuivering van microtubuli en geassocieerde eiwitten en RNAs, kan deze benadering worden gegeneraliseerd naar andere subcellulaire structuren. Terwijl de meeste gelokaliseerde mRNA werden niet geïdentificeerd met biochemische werkwijzen de recente vorderingen in DNA en RNA sequencing technologie biedt een aantrekkelijke aanpak methode om gelokaliseerde RNAs identificeren. In deze benadering elke subcellulaire of sub-embryo structuur van belang zou kunnen worden geïsoleerd of gezuiverd. Dan is de bijbehorende eiwitten en RNA's kunnen worden geïdentificeerd op een genoom-wijde schaal. RNA kan dan worden vergeleken met de RNA inhoud van het totale aantal cellen of embryo verrijkte gelokaliseerde RNAs identificeren. Deze benadering kan worden gebruikt met hele eieren (dierlijk en plantaardig scheiding, vergelijkbaar met de benadering die de eerste gelokaliseerde RNA geïdentificeerd in Xenopus 27), actine geassocieerde RNAs, ER-geassocieerde RNAs, mitochondria geassocieerde RNAs, of een subcellulaire structuur die kan worden gezuiverd met bijbehorende RNA intact. Gebaseerd opons werk microtubule-geassocieerde RNA voorspellen we dat dit een uitstekende methode om nieuwe eiwitten die functioneren op een bepaalde locatie te ontdekken zijn. Bovendien zal de identificatie van de locatie en de omvang van alle gelokaliseerde RNA's inzicht geven in hoe cellen en embryo's te gebruiken mRNA lokalisatie om genexpressie te controleren.
The authors have nothing to disclose.
REAGENTS | |||
Xenopus tropicalis | NASCO | LM00823MX | |
human Chorionic Gonadotropin | Sigma-Aldrich | CG10 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C8106 | |
sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Leupeptin | Sigma-Aldrich | L9783 | |
Pepstatin | Sigma-Aldrich | P5318 | |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 | |
Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
Gelatin, porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
Taxol | Sigma-Aldrich | T7191 | |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
L-Cysteine, free base | USB Corporation | 14030 | |
Cichlid Lake Salt | Seachem | 47894 | |
Marine salt | Seachem | SC7111 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
EQUIPMENT | |||
1 ml syringes | BD Biosciences | 309659 | |
18 gauge needles | BD Biosciences | 305195 | |
30 gauge needles | BD Biosciences | 305106 | |
Rubbermaid Plastic bucket | Amazon | 6306 | |
Beckman Polyallomer 2 x ½ inch Ultracentrifuge tubes | Beckman | 326819 | |
15 ml round-bottomed glass centrifuge tubes | Fisher Scientific | 45500-15 | |
Rubber adapter sleeves for 15 ml tubes | Kimble-Chase | 45550-15 | |
5 ¾ inch glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
14 ml polypropylene round-bottom tube | BD Biosciences | 352059 | |
Sorvall HB-6 rotor | Thermo Scientific | 11860 | |
Sorvall RC-6 centrifuge | Thermo Scientific | 46910 |