Vi beskriver samlingen av ubefruktet<em> Xenopus tropicalis</em> Egg og produksjon av en meiose II-arrestert egg ekstrakt. Denne egg ekstrakt kan brukes til å rense mikrotubuli og mikrotubulus-assosierte RNA'er.
Mange organismer lokalisere mRNA til bestemte subcellular omgivelsen til romlig og tidsmessig kontroll genuttrykk. Nyere studier har vist at størstedelen av transcriptome er lokalisert til et nonrandom stilling i celler og embryoer. En måte å identifisere lokaliserte mRNA er å biokjemisk rense en cellestruktur av interesse og for å identifisere alle tilhørende transkripsjoner. Ved hjelp av nylig utviklede høy gjennomstrømming sekvensering teknologier er det nå enkelt å identifisere alle RNA assosiert med en subcellulære struktur. For å lette transkripsjon identifikasjon er det nødvendig å arbeide med en organisme med et fullt sekvensert genom. En attraktiv system for biokjemisk rensing av subcellular strukturer er egg ekstrakter produsert fra frosken Xenopus laevis. Men X. laevis for tiden ikke har en fullt sekvensert genomet, som vanskeliggjør transkripsjon identifikasjon. I denne artikkelen beskriver vi en metodeå produsere egg utdrag fra en relatert frosk, X. tropicalis, som har en fullt sekvensert genom. Vi gir detaljer for microtubule polymerisasjon, rensing og karakterutskrift isolasjon. Mens denne artikkelen beskriver en spesifikk metode for identifisering av mikrotubulus-assosierte transkripter, tror vi at det vil være lett brukes på andre subcellulære strukturer og vil gi en kraftig metode for identifisering av lokaliserte RNAer.
Romlig og tidsmessig kontroll av genekspresjon er viktig for alle celler, og er spesielt viktig for kontroll av tidlig fosterdød pattering en. Romlig kontroll av genuttrykk oppnås gjennom aktiv lokalisering av mRNA til bestemte destinasjoner innenfor celler eller embryoer. I mange svært store celletyper, (f.eks egg, embryoer, og nevroner) mRNA lokalisering brukes til å begrense protein uttrykk i stedet for handling av det kodede protein. Siden en lokalisert mRNA kan katalysere mange runder med protein produksjon er det mer effektivt å lokalisere en mRNA enn å lokalisere enkelte protein molekyler. Lokaliserte mRNA er vanligvis translationally undertrykt før de når sin destinasjon, som tjener til å ytterligere begrense lokalisering av det kodede protein to. I tillegg til de mange godt dokumenterte hendelser av RNA lokalisering for å kontrollere embryonale rutemønster som har flere studier dokumentert mRNA som er lokaliserttil åsted for handlingen i den kodede protein. Prominent eksempler er lokalisering av β-actin 3 og Arp2 / 3 4 mRNA til forkanten av bevegelige fibroblaster og lokalisering av mRNA for mange mitotiske regulatorer å meiotisk og mitosetråder 5-7.
Mange av de klassiske eksemplene på lokaliserte mRNA ble identifisert gjennom genetiske skjermer for mors effekt mutasjoner og ble senere fastslått å kode lokaliserte RNA. Imidlertid har nyere genome-wide studier begynt å gi bredere innsikt i omfanget av lokaliserte RNA. En nylig in situ hybridisering skjerm i Drosophila embryo viste at ~ 70% av alle mRNA har en bestemt lokalisering, inkludert mange nye destinasjoner 8. Rensing av pseudopodia fra musefibroblaster identifisert en mangfoldig gruppe av lokaliserte mRNA ni. Arbeid fra vår gruppe ved hjelp av biokjemiske rensing av mikrotubuli fra meiotisk Xenopus egg ekstrakter identifisert hundrevis av mRNA som copurify med spindelen 5,7. Vårt arbeid viste at flertallet av microtubule-lokaliserte mRNA koder proteiner som fungerer i kontroll av mitose, støtter ideen om at mRNA er lokalisert til området av handlingen i den kodede protein. Videre fremhever evnen til å oppdage mRNA berikelse i en subcellular brøkdel av biokjemisk rensing kraften i denne tilnærmingen for identifisering av lokaliserte mRNA.
Mest lokaliserte RNA bruke aktiv transport på cytoskjelettet, enten actin eller mikrotubuli, for å oppnå transport til det endelige målet 10. For å få en bedre forståelse av omfanget og typene av RNA som er lokalisert til bestemte destinasjoner ved hjelp av en biokjemisk metode er det nødvendig å ha et in vitro-system som kan recapitulate cytoskeletal prosesser. En av de fremste systemer for å studere cytoskeletal biologi er egg ekstrakter produsertfra ubefruktede egg fra frosken Xenopus laevis. X. laevis egg ekstrakter har blitt brukt i flere tiår for å studere et bredt spekter av cytoskeletal prosesser og har bidratt mye til vår forståelse av mekanismene og molekyler som styrer cytoskeletal montering og dynamikk 11. Videre X. laevis egg ekstrakter er mottagelig for store purifications av mikrotubuli og tilhørende proteiner 12,13 og det er godt designet metoder for produksjon av ulike typer egg ekstrakter 14-16. Men for genomisk studier er det flere ulemper til bruk av X. laevis som modellsystem.
I flere tiår Xenopus laevis frosker har vært et kraftig system for studier av utviklings-og cellebiologi, på grunn av den store eggcelle størrelse og robust ytre utvikling 17. Videre utvikling av egg ekstrakt systemer som kan rekapitulere mange mobilnettet processes i et reagensrør har gjort dette frosk en kraftig eksperimentell modell. Imidlertid har Xenopus laevis vært hemmet av mangel på et komplett genom sekvens, som har blitt bremset av allotetraploid natur genome.In kontrast, har et nært beslektede arter, Xenopus tropicalis, en diploid genom som ble sekvensert i 2010 18. Mens X. tropicalis er ikke så eksperimentelt medgjørlig som X. laevis 17 tilgjengeligheten av en sekvensert genom gjør det til en attraktiv modell system for å utføre genom brede analyser.
I denne rapporten beskriver vi en metode for å gjøre meiose II-, cytostatiske factor-arrestert ekstrakter (CSF) fra X. tropicalis 19. Vi beskriver så en enkel metode for å rense mikrotubuli og tilhørende RNA'er fra denne ekstrakt. De RNA kan deretter konverteres til bibliotekene mottagelig for sekvensering bruker nyutviklede høy gjennomstrømming sekvensering teknologier. Når bibliotekeneer sekvensert de kan bli justert til genomet av frosken å identifisere spesifikke mRNA som er beriket i microtubule prøven i forhold til total ekstrakt. Dette gir en kraftig metode for å detektere microtubule-målrettet mRNA lokalisering på et genom-wide skala. I tillegg til å være i stand til å oppdage lokaliserte mRNA, bruk av high-throughput sekvensering og sekvensert genomet tilbyr muligheten for å oppdage nye vitnemål som for øyeblikket ikke er til stede i offentlig database merknader.
I denne rapporten har vi beskrevet en enkel metode for å produsere CSF-arrestert egg ekstrakter fra X. tropicalis 19 og bruke dette ekstraktet for å studere microtubule-tilknyttede RNA 7. Den grunnleggende prosedyren for å produsere CSF-arrestert egg ekstrakter fra X. tropicalis er det samme som anvendt for X. laevis med noen viktige forskjeller. En av de mest utfordrende sidene til å jobbe med X. tropicalis frosker er å skaffe nok høy kvalitet egg for å lage et utdrag med microtubule nucleation eller spindelenheten aktivitet sammenlignes med X. laevis egg ekstrakter. For å oppnå optimale egglegging forhold mens hindre glidning fra meiose II cellesyklus arrest, intervallet mellom hormon injeksjoner for X. tropicalis er kortere enn det som brukes for X. laevis, og tidspunktet fra den tredje hCG-injeksjonen til begynnelsen av egglegging er også mye kortere. Med X. laevis timingen fra hCG-injeksjonen til than begynnelsen av det å legge egg er slik at det er praktisk og effektiv for egg for å legges over natten i buffer. Imidlertid, på grunn av den kortere tid mellom hCG-injeksjonen og egglegging med X. tropicalis er det ofte nødvendig å manuelt uttrykke egg fra frosker. En annen vesentlig forskjell mellom å gjøre egg ekstrakt fra de to forskjellige frosker er dejellying trinn. Med X. laevis eggene er så stor at det er lett å avgjøre når gelé pelsen er oppløst ved å observere hvor nært eggene er plassert i begeret. Som dejellying reaksjon starter, eggene begynner å pakke tettere. Men X. tropicalis egg er mye mindre og det kan være ganske vanskelig å avgjøre når gelé coat har oppløst av egg pakking tetthet alene. Vi har funnet ut at den mest pålitelige metoden for å bestemme når gelé strøk er oppløst, er å overvåke retningen på dyret (svart) og vegetal (hvit) polene. Når alle vegetal stolper orient mot bunnen av begerglasset gelé belegge er fjernet nok til å fortsette med ekstraktet. Til slutt, mens X. laevis egg ekstrakt kan lagres på kjølige temperaturer (4-12 ° C) har vi observert at det er avgjørende å opprettholde X. tropicalis egg ekstrakt ved romtemperatur (20-25 ° C) i løpet av fremstilling og eksperimentelle manipulasjoner for å bevare biokjemisk aktivitet. På grunn av forskjellene i brukervennlighet foretrekker vi å bruke X. laevis frosker for produksjon av egg ekstrakt. Men for eksperimenter som krever eller er tilrettelagt av en organisme med en koplende genom, X. tropicalis er et utmerket alternativ system.
Metoden som vi har beskrevet i denne rapporten bruker Noel Coward som en microtubule-stabiliserende middel for å indusere microtubule polymerisasjon. Vi valgte denne metoden fordi taxol er en robust mikrotubulus-stabiliserende middel som muliggjør storskala isolering av renset mikrotubuli. Metoden thpå vi beskrev kunne trolig bli forbedret ved å sammenligne proteiner og RNAene forbundet med mikrotubuli ved hjelp av alternative microtubule polymerisasjonsmetoder. Alternativer kan omfatte polymerisering hjelp GTP-indusert polymerisasjon (en klassisk teknikk), 22 eller ved hjelp av Ran-GTP som microtubule polymerizer å etterligne mikrotubuli indusert av kromatin-drevet spindelenheten 23. Til slutt, bruk av renset sperm kjerner å indusere microtubule polymerisasjon vil være det nærmeste etterligne til hvilke typer mikrotubuli som nukleerte under mitose (sentrosomen, kromatin, og kinetochore mediert). Ulemper med disse alternative kilder av mikrotubulus kjernedannelse er at de kjernedannende midler er ikke så lett tilgjengelig som Taxol og de ikke kjernekoking eller stabiliserer mikrotubuli så effektivt som taxol. Derfor ville hver av disse metodene være vanskeligere å bruke for store purifications. Fordelen ved å sammenligne flere forskjellige typer mikrotubulidynamikk nukleatorerer at det kan være mulig å identifisere proteiner og / eller RNA'er som er spesifikke for hver vei av mikrotubuli kjernedannelse.
Metoden som vi har beskrevet her tar nytte av cytoplasma ekstrakter av amfibier. Imidlertid kan denne metoden bli utvidet til bruken av ekstrakt system fra andre organismer. Mitotisk ekstrakter har blitt beskrevet fra synkroniserte menneskelig vev kultur celler 24 som trofast rekapitulere mange aspekter av microtubule montering. Vi har med hell brukt disse ekstrakter å identifisere microtubule-tilknyttede RNA fra Jakten celler fem. Lignende microtubule rensing ordninger har blitt beskrevet i mange forskjellige organismer 25,26, selv om microtubule forbundet RNA har ikke blitt undersøkt. Fremgangsmåten beskrevet her kan bli brukt med hvilken som helst organisme som kan produsere et konsentrert cytoplasmisk ekstrakt stand kjernedannende mikrotubuli.
Til slutt, selv om den fremgangsmåte som vi deskriftlærd her diskuterer rensing av mikrotubuli og tilhørende proteiner og RNA, kan denne tilnærmingen være generaliseres til andre subcellular strukturer. Mens de fleste lokaliserte mRNA ikke har blitt identifisert ved hjelp av biokjemiske metoder de siste fremskritt innen DNA og RNA sekvensering teknologier gjør denne tilnærmingen en attraktiv metode for å identifisere lokaliserte RNA. I denne framgangsmåten være subcellulære eller sub-embryo strukturen av interesse kan bli isolert eller renset. Da de tilknyttede proteiner og RNA'er kan identifiseres på et genom bred skala. RNA kan deretter sammenlignes med den RNA-innholdet av det totale celle eller embryo for å identifisere anrikede lokaliserte RNAer. Denne tilnærmingen kan brukes med hele egg (dyr og vegetal separasjon, lik den tilnærmingen som identifiserte de første lokaliserte RNA i Xenopus 27), aktin tilknyttede RNAene, ER-tilknyttede RNAene, mitokondrier-tilknyttede RNAene, eller noen subcellular struktur som kan bli renset med tilhørende RNA intakt. Basert påvårt arbeid på microtubule-assosiert RNA vi spår at dette ville være en utmerket metode for å oppdage nye proteiner som fungerer på et gitt sted. Videre vil identifikasjon av lokalisering og omfang av alle lokaliserte RNA gi innsikt i hvordan celler og embryoer bruke mRNA lokalisering for å kontrollere genuttrykk.
The authors have nothing to disclose.
REAGENTS | |||
Xenopus tropicalis | NASCO | LM00823MX | |
human Chorionic Gonadotropin | Sigma-Aldrich | CG10 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C8106 | |
sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Leupeptin | Sigma-Aldrich | L9783 | |
Pepstatin | Sigma-Aldrich | P5318 | |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 | |
Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
Gelatin, porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
Taxol | Sigma-Aldrich | T7191 | |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
L-Cysteine, free base | USB Corporation | 14030 | |
Cichlid Lake Salt | Seachem | 47894 | |
Marine salt | Seachem | SC7111 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
EQUIPMENT | |||
1 ml syringes | BD Biosciences | 309659 | |
18 gauge needles | BD Biosciences | 305195 | |
30 gauge needles | BD Biosciences | 305106 | |
Rubbermaid Plastic bucket | Amazon | 6306 | |
Beckman Polyallomer 2 x ½ inch Ultracentrifuge tubes | Beckman | 326819 | |
15 ml round-bottomed glass centrifuge tubes | Fisher Scientific | 45500-15 | |
Rubber adapter sleeves for 15 ml tubes | Kimble-Chase | 45550-15 | |
5 ¾ inch glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
14 ml polypropylene round-bottom tube | BD Biosciences | 352059 | |
Sorvall HB-6 rotor | Thermo Scientific | 11860 | |
Sorvall RC-6 centrifuge | Thermo Scientific | 46910 |