Se describe la colección de fertilizar<em> Xenopus tropicalis</em> Los huevos y la producción de un extracto de huevo II-arrestado meiosis. Este extracto de huevo se puede utilizar para purificar los microtúbulos y ARN asociadas a los microtúbulos.
Muchos organismos localizar mRNAs a destinos subcelulares específicos para la expresión de genes de control espacial y temporalmente. Estudios recientes han demostrado que la mayoría del transcriptoma se localiza en una posición aleatoria en las células y embriones. Un enfoque para identificar ARNm localizados es para purificar bioquímicamente una estructura celular de interés y para identificar todas las transcripciones asociadas. Uso de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento recientemente desarrollados ahora es sencillo identificar todos los RNAs asociados a una estructura subcelular. Para facilitar la identificación de transcripción que es necesario trabajar con un organismo con un genoma secuenciado en su totalidad. Un sistema atractivo para la purificación bioquímica de las estructuras subcelulares son extractos de huevos producidos a partir de la rana Xenopus laevis. Sin embargo, X. laevis actualmente no tiene un genoma secuenciado en su totalidad, lo que dificulta la identificación transcripción. En este artículo se describe un métodopara producir extractos de huevo de una rana relacionada, X. tropicalis, que tiene un genoma secuenciado en su totalidad. Proporcionamos información para la polimerización de microtúbulos, purificación y aislamiento transcripción. Mientras que este artículo se describe un método específico para la identificación de las transcripciones asociadas a los microtúbulos, creemos que se puede aplicar fácilmente a otras estructuras subcelulares y proporcionará un método potente para la identificación de ARN localizados.
El control espacial y temporal de la expresión de genes es importante para todas las células, y es especialmente importante para el control de los primeros embrionario golpeteo 1. El control espacial de la expresión génica se consigue a través de la localización activa de los ARNm a destinos específicos dentro de las células o embriones. En muchos tipos de células muy grandes, (por ejemplo, oocitos, embriones, y las neuronas) la localización del mRNA se utiliza para restringir la expresión de la proteína con el sitio de acción de la proteína codificada. Desde un ARNm localizada puede catalizar muchas rondas de producción de proteínas que es más eficiente para localizar un ARNm que para localizar moléculas de proteína individuales. ARNm están localizados típicamente en traslación reprimidos hasta que llegan a su destino, que sirve para limitar aún más la localización de la proteína codificada 2. Además de los muchos casos bien documentados de localización del ARN para controlar el desarrollo embrionario, varios estudios han documentado los ARNm que se localizanpara el sitio de acción de la proteína codificada. Ejemplos destacados incluyen la localización de la β-actina 3 y Arp2 / 3 4 ARNm para el borde de ataque de los fibroblastos móviles y localización de los ARNm para muchos reguladores mitóticas y meióticas a husos mitóticos 5-7.
Muchos de los ejemplos clásicos de ARNm localizadas fueron identificados a través de las pantallas de genética para las mutaciones de efectos maternos y más tarde se determinó que codifican ARN localizadas. Sin embargo, los estudios del genoma recientes han comenzado a proporcionar una visión más amplia en el ámbito de los ARN localizadas. Un reciente en la pantalla de hibridación in situ en embriones de Drosophila demostrado que ~ 70% de todos los mRNAs tienen una localización específica, incluyendo muchos destinos novedosos 8. La purificación de pseudópodos de fibroblastos de ratón identificado un grupo diverso de ARNm localizada 9. El trabajo de nuestro grupo utilizando purificación bioquímica de los microtúbulos de meiótica Xenopus huevo extractos identificados cientos de mRNAs que copurifican con el husillo 5,7. Nuestro trabajo mostró que la mayoría de los ARNm de microtúbulos localizadas codifican proteínas que funcionan en el control de la mitosis, el apoyo a la idea de que los ARNm se localizan en el sitio de acción de la proteína codificada. Por otra parte, la capacidad de detectar el enriquecimiento ARNm en una fracción subcelular por purificación bioquímica pone de relieve la potencia de este enfoque para la identificación de los ARNm localizadas.
La mayoría de los ARN localizados utilizan transporte activo en el citoesqueleto, ya sea actina o los microtúbulos, para lograr un transporte a su destino final 10. Para obtener una mejor comprensión de la extensión y los tipos de ARN que se localizan a destinos específicos utilizando un enfoque bioquímico es necesario disponer de un sistema in vitro que pueden recapitular los procesos del citoesqueleto. Uno de los sistemas principales para el estudio de la biología del citoesqueleto es extractos de huevos producidosa partir de huevos no fertilizados de la rana Xenopus laevis. X. extractos de huevo laevis se han utilizado durante décadas para estudiar una amplia gama de procesos citoesqueleto y han contribuido mucho a nuestra comprensión de los mecanismos y las moléculas que controlan el conjunto del citoesqueleto y la dinámica 11. Además, X. extractos de huevo laevis son susceptibles de purificación a gran escala de los microtúbulos y proteínas asociadas a 12,13 y existen métodos bien diseñados para la producción de diversos tipos de extractos de huevo 14-16. Sin embargo, para los estudios genómicos hay varios inconvenientes a la utilización de X. laevis como un sistema modelo.
Durante décadas ranas Xenopus laevis han sido un potente sistema para el estudio de la biología del desarrollo y celular, debido al gran tamaño de los ovocitos y robusto desarrollo externo 17. Por otra parte, el desarrollo de los sistemas de extracto de huevo que pueden recapitular muchos processe celulars en un tubo de ensayo se ha hecho de esta rana de un modelo experimental de gran alcance. Sin embargo, Xenopus laevis se ha visto obstaculizada por la falta de una secuencia completa del genoma, que se ha ralentizado por la naturaleza de alotetraploide el contraste genome.In, una especie estrechamente relacionada, Xenopus tropicalis, tiene un genoma diploide que fue secuenciado en 2010 18. Mientras X. tropicalis no es tan experimentalmente tratable como X. laevis 17 la disponibilidad de un genoma secuenciado hace que sea un sistema de modelo atractivo para realizar análisis de todo el genoma.
En este informe se describe un método para hacer la meiosis II-, citostáticos extractos factor detenidos (LCR) de X. tropicalis 19. Se describe a continuación un método sencillo para purificar microtúbulos y ARN asociados a partir de este extracto. Los ARN a continuación, se pueden convertir en bibliotecas susceptibles de secuenciación usando las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento desarrollados recientemente. Una vez que las bibliotecasse secuenciaron que pueden ser alineados con el genoma de la rana para identificar ARNm específicos que se enriquecen en la muestra de microtúbulos en comparación con el extracto total. Esto proporciona un método eficaz para detectar la localización del mRNA microtúbulos orientados en un genoma de gran escala. Además de ser capaz de detectar ARNm localizadas, el uso de secuenciación de alto rendimiento y un genoma secuenciado ofrecen la posibilidad de descubrir nuevas transcripciones que no están actualmente presentes en las anotaciones de bases de datos públicas.
En este informe hemos descrito un método sencillo para producir extractos de huevo CSF-detenidos de X. tropicalis 19 y utilizar este extracto para estudiar los ARN asociadas a los microtúbulos 7. El procedimiento básico para la producción de extractos de huevo de CSF-detenidos de X. tropicalis es el mismo que el utilizado para X. laevis con algunas diferencias clave. Uno de los aspectos más difíciles de trabajar con X. ranas tropicalis es la obtención de huevos lo suficientemente alta calidad para hacer un extracto con la nucleación de microtúbulos o actividad conjunto de eje comparable a X. extrae laevis huevo. Para lograr óptimas condiciones de puesta de huevos al tiempo que evita el deslizamiento de la meiosis II detención del ciclo celular, el intervalo entre las inyecciones de la hormona para X. tropicalis es más corta que la utilizada para X. laevis, y la temporización a partir de la tercera inyección de hCG para el inicio de la puesta de huevos también es mucho más corto. Con X. laevis la sincronización de la inyección de hCG para tél comienzo de la puesta de huevos es tal que es conveniente y eficiente para los huevos que se establezcan durante la noche en tampón. Sin embargo, debido al tiempo más corto entre la inyección de hCG y la puesta de huevos con X. tropicalis con frecuencia es necesario para expresar manualmente los huevos de ranas. Otra diferencia significativa entre hacer extracto de huevo de las dos ranas diferentes es el paso dejellying. Con X. laevis los huevos son tan grandes que es fácil de determinar cuando la capa de gelatina se haya disuelto mediante la observación de cómo de cerca se espacian los huevos en el vaso de precipitados. Como la reacción dejellying comienza, los huevos comienzan a acumular más y más denso. Sin embargo, X. huevos tropicalis son mucho más pequeños y puede ser bastante difícil determinar cuándo la capa de gelatina se haya disuelto por el huevo de la densidad de empaquetamiento solo. Hemos encontrado que el método más fiable para determinar cuando la capa de gelatina se haya disuelto es para controlar la orientación del animal (negro) y polos vegetales (blanco). Cuando todo el vegetal polos orient hacia la parte inferior del vaso de precipitados de la capa de gelatina se ha eliminado suficiente para proceder con el extracto. Por último, mientras que X. extracto de huevo laevis se puede almacenar a temperaturas frías (4-12 ° C) se ha observado que es crítico para mantener X. extracto de huevo tropicalis a temperatura ambiente (20-25 ° C) durante la preparación y manipulaciones experimentales para preservar la actividad bioquímica. Debido a las diferencias en la facilidad de uso se prefiere usar X. laevis ranas para la producción de extracto de huevo. Sin embargo, para los experimentos que requieren o son facilitadas por un organismo con un genoma secuenciado, X. tropicalis es un sistema excelente alternativa.
El método que hemos descrito en este informe utiliza taxol como un agente estabilizador de microtúbulos para inducir la polimerización de microtúbulos. Elegimos este método porque el taxol es un agente estabilizador de microtúbulos-robusto que facilita el aislamiento a gran escala de los microtúbulos purificada. El método ªpor lo que describimos podría probablemente ser mejorado mediante la comparación de las proteínas y ARN asociados con los microtúbulos mediante métodos alternativos de polimerización de microtúbulos. Alternativas pueden incluir polimerización utilizando polimerización inducida por GTP (una técnica clásica), 22 o el uso de Ran-GTP como un polimerizador microtúbulos para imitar los microtúbulos inducida por conjunto de husillo accionado cromatina-23. Por último, el uso de núcleos de los espermatozoides purificada para inducir la polimerización de microtúbulos sería el más cercano imitan a los tipos de microtúbulos que se nuclean durante la mitosis (centrosoma, la cromatina, y cinetocoro mediada). Los inconvenientes de estas fuentes alternativas de nucleación de microtúbulos son que los agentes de nucleación no son tan fácilmente disponibles como taxol y no lo hacen nucleada o estabilizan los microtúbulos tan eficientemente como el taxol. Por lo tanto, cada uno de estos métodos sería más difícil de utilizar para purificaciones a gran escala. La ventaja de comparar múltiples diferentes tipos de nucleadores microtúbuloses que podría ser posible identificar proteínas y / o ARN que son específicos para cada vía de nucleación de microtúbulos.
El método que hemos descrito aquí se aprovecha de los extractos citoplasmáticos de anfibios. Sin embargo, este enfoque podría extenderse a la utilización de sistema de extracción de otros organismos. Extractos mitóticas se han descrito desde sincronizados células de cultivo de tejidos humanos 24 que fielmente recapitular muchos aspectos de ensamblaje de los microtúbulos. Hemos utilizado con éxito estos extractos para identificar los ARN asociadas a los microtúbulos a partir de células HeLa 5. Esquemas de purificación de microtúbulos similares se han descrito para muchos organismos diferentes 25,26, aunque los RNAs asociados microtúbulos no se han examinado. El enfoque descrito aquí podría ser utilizado con cualquier organismo que puede producir un extracto citoplásmico concentrada capaz de nucleación microtúbulos.
Por último, aunque el enfoque que deescriba aquí habla de la purificación de los microtúbulos y proteínas asociadas y ARN, este enfoque podría ser generalizado a otras estructuras subcelulares. Mientras que la mayoría de los ARNm localizadas no han sido identificados utilizando métodos bioquímicos los recientes avances en las tecnologías de secuenciación de ADN y ARN que este enfoque sea un método atractivo para identificar los ARN localizados. En este enfoque cualquier estructura subcelular o sub-embrión de interés se puede aislar o purificar. A continuación, las proteínas y ARN asociados se pueden identificar en una amplia escala de genoma. ARN a continuación, se pueden comparar con el contenido de ARN total de células del embrión o para identificar los ARN localizados enriquecidos. Este enfoque podría ser utilizado con los huevos enteros (animales y separación vegetal, similar al enfoque que se identificó el primer ARN localizadas en Xenopus 27), actina RNAs asociados, ARN ER-asociados, ARN mitocondrial asociadas, oa cualquier estructura subcelular que pueden ser purificado con ARN asociados intactas. Basado ennuestro trabajo en el ARN asociada a los microtúbulos que predecir que esto sería un excelente método para descubrir nuevas proteínas que funcionan en una ubicación determinada. Por otra parte, la identificación de la localización y extensión de todos los ARN localizadas proporcionará información sobre cómo las células y embriones utilizan localización del mRNA para controlar la expresión génica.
The authors have nothing to disclose.
REAGENTS | |||
Xenopus tropicalis | NASCO | LM00823MX | |
human Chorionic Gonadotropin | Sigma-Aldrich | CG10 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C8106 | |
sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Leupeptin | Sigma-Aldrich | L9783 | |
Pepstatin | Sigma-Aldrich | P5318 | |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 | |
Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
Gelatin, porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
Taxol | Sigma-Aldrich | T7191 | |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
L-Cysteine, free base | USB Corporation | 14030 | |
Cichlid Lake Salt | Seachem | 47894 | |
Marine salt | Seachem | SC7111 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
EQUIPMENT | |||
1 ml syringes | BD Biosciences | 309659 | |
18 gauge needles | BD Biosciences | 305195 | |
30 gauge needles | BD Biosciences | 305106 | |
Rubbermaid Plastic bucket | Amazon | 6306 | |
Beckman Polyallomer 2 x ½ inch Ultracentrifuge tubes | Beckman | 326819 | |
15 ml round-bottomed glass centrifuge tubes | Fisher Scientific | 45500-15 | |
Rubber adapter sleeves for 15 ml tubes | Kimble-Chase | 45550-15 | |
5 ¾ inch glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
14 ml polypropylene round-bottom tube | BD Biosciences | 352059 | |
Sorvall HB-6 rotor | Thermo Scientific | 11860 | |
Sorvall RC-6 centrifuge | Thermo Scientific | 46910 |