Живых изображений сотовый событий раннего этапа Аутофагия: Omegasomes и на последующий период
Summary
Покадровый микроскопии флуоресцентно меченных аутофагию маркеров позволяет отслеживать динамические характеристики аутофагию с высоким временным разрешением. Использование конкретного аутофагия и органелл маркеров в комбинации из 3 различных цветов, можно следовать вклада белка аутофагосом образование в прочном пространственной и временной контекст.
Abstract
Аутофагия клеточный ответ вызвано недостатком питательных веществ, особенно отсутствие аминокислот. Аутофагия определяется образованием двойной мембранных структур, называемых аутофагосомы, которые способствуют удалению цитоплазме, долгоживущие белки и белковые агрегаты, дефектные органелл и даже вирусы или бактерии. Аутофагосомы в конечном итоге сливаются с лизосом приводит к объемной деградации их содержания, с полученным время питательные вещества возвращаются обратно в цитоплазму. Поэтому аутофагию имеет решающее значение для клеточного гомеостаза и регуляции аутофагии может привести к болезни, в первую очередь нейродегенерацию, старение и рак.
Аутофагосом образование очень сложный процесс, в котором клетки выделили определенной группы белков, называемых техники ядро аутофагия. MACHINERY CORE аутофагия функционально дополнена дополнительными белками, участвующими в различных клеточных процессах, например, в мембранныхэлектронной торговли, в митохондриальных и лизосомальных биологии. Координация этих белков для формирования и деградации аутофагосом является очень динамичной и сложной реакции аутофагии. Изображений живых клеток позволяет следовать молекулярной вклад каждого аутофагия-родственного белка до уровня одного аутофагосом событие формирования и в реальном времени, поэтому этот метод обеспечивает высокую временным и пространственным разрешением.
Здесь мы используем клеточной линии, стабильно экспрессирующие GFP-DFCP1, установить пространственные и временные условия для нашего анализа. DFCP1 omegasomes знаки, которые являются предшественником структур, приводящих к образованию аутофагосомы. Белка интереса (POI) могут быть помечены либо с красной или голубой флуоресцентной метки. Разные органеллы, как ER, митохондрий и лизосом, все вовлечены в различные этапы формирования аутофагосом, и могут быть отмечены с помощью специального красителя трекера. Покадровый микроскопии AUTOPHagy в этой экспериментальной установки, позволяет информации быть извлечены о четвертом измерении, т.е. время. Следовательно, мы можем следить за вклад в аутофагию POI в пространстве и времени.
Introduction
Аутофагия весьма динамичный процесс, который требует координации большого количества белков для конечного результата аутофагосом формирования 1-3. Микроскопия, вероятно, техника чаще всего используется для изучения аутофагии 4. Локализация наиболее аутофагию белки широко изучалась в фиксированных клетках, как по иммуно-окрашивания эндогенных белков и выражение флуоресцентно меткой экзогенных белков. Кроме того, электронная микроскопия (ЭМ), самостоятельно и в сочетании с иммуно-золотые маркировки, описал мельчайшие детали этих структур 5,6. Несмотря на то, что эти методы создали наше понимание аутофагосом образованием в 3-х измерениях пространства, они не в состоянии обеспечить достаточное количество информации о 4-е измерение – время. Изображений живых клеток преодолевает этот барьер, так как позволяет после формирования аутофагосом настолько близко, насколько возможнымBLE к реальному времени 7. Этот метод был впервые применен для изучения аутофагии Yoshimori и коллеги 8, и все чаще использоваться в дальнейшем.
Покадровый микроскопии захватывает локализации POI в живых клетках и в течение периода времени. Сравнивая эту информацию с хорошо характеризуется аутофагию и / или органеллы маркером, живая анализа изображений Сотовые можете поставить POI в большем пространственном и временном контексте аутофагосом формирования. Онлайн-анализа изображений Сотовые основан на повторяющихся захвату POI по локализации все шаги аутофагосом образование, в то время как изображения основных клеток на основе одного захвата. Поэтому изображений живых клеток может оказаться вклад POI в определенных шагов аутофагосом формирования, в то время как изображения основных клетки могут взять на себя роль POI, исходя из его средней локализации во многих аутофагосомы одновременно захватываются в различных стадиях их lifecyНКУ.
Хотя изображений живых клеток является методом высокой аналитические возможности, она имеет некоторые ограничения, присущие, которые должны быть приняты во внимание. Прежде всего, изображений живых клеток требует экспрессии одного или более экзогенных флуоресцентно меченных белков. Флуоресцентные теги, как правило, большие по размеру и иногда они могут изменять поведение белка вследствие стерических причин. Эта ситуация усугубляется для мембранных белков, так как они должны работать в ограниченном пространстве 2 размеры оболочки. Следует отметить, что аутофагосомы являются мембранных структур и, соответственно, их образование требует большого количества мембранных белков, ассоциированных с.
Другой ряд проблем связана с уровни экспрессии POI. В принципе, экзогенных белков должно быть выражено на уровне, сопоставимом с эндогенным белком. Это гарантирует, что важные регуляторы его суб-клеточная локализация не будет насыщен, и гоэлектронной анализ будет биологически значимых. Кроме того, сверхэкспрессия белков аутофагия следует избегать, так как, когда они выражены выше эндогенные уровни, они имеют тенденцию к ингибированию аутофагия ответ 9. С другой стороны, так как уровни экспрессии POI должна быть достаточно высокой, чтобы после его локализации для хорошего периода времени без фотообесцвечивания, компромисс должен быть достигнут. Достижение оптимального уровня экспрессии экзогенного белка в клетках млекопитающих требует много тонкой настройки, но это возможно путем создания и скрининга клеточные линии, стабильно экспрессирующие различные уровни POI.
Пространственное разрешение, которое может быть достигнуто при стандартной флуоресцентной микроскопии другой ограничивающим фактором. Разрешение может быть ограничено по ряду причин, но в лучшем случае, боковые разрешение будет около 250 нм. Это означает, что любые объекты на расстоянии меньше, чем это будет выглядеть подключен (или в виде одногообъекта) и объектов меньше, чем 250 нм будет представлена в образе больше, чем они на самом деле. Поэтому изображения всегда следует интерпретировать с учетом этого и дополнительные методы, такие как EM будет необходимо решить ультра-тонкий структурных деталей.
Наконец, изображений живых клеток по существу требует подвергая клетки к свету, потенциально в течение длительного периода времени. Это может привести к изменению физиологических реакций клетки, явление, известное как фото-токсичности.
Мы успешно использовали изображений живых клеток из PI3P-связывающий белок DFCP1 описать в первый раз, что аутофагосомы происходят из богатых PI3P кольцевые структуры называются omegasomes, которые находятся в тесной связи с нитями ER 10,11. Мы четко показали, что LC3-положительные структуры начинают формироваться в тесной связи с omegasomes. Мы здесь, показывают, что использование клеточной линии, стабильно экспрессирующие GFP-DFCP1 для живой клеткивизуализации белка, представляющего интерес, создает надежную пространственные и временные рамки для характеризации его роль в формировании аутофагосом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод, описанный в этом протоколе позволяет визуализировать локализацию белка во время аутофагосом формирования. Мы пробовали различные методы визуализации событий, описанных включая линии сканирующей конфокальной, вращающийся диск конфокальной и флуоресцентной полного внутренне?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Наша работа опирается на биотехнологии и биологических наук Исследовательского Совета. Мы хотели бы поблагодарить профессора Тамоцу Yoshimori за любезно снабжают нас плазмиды для экспрессии CFP-LC3.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 41965 | |
| OptiMEM I | Invitrogen | 31985-062 | |
| MitoTracker Red FM | Invitrogen | M22425 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 | |
| X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche Applied Science | 6365787001 | |
| 22 mm coverslips | VWR | 631-0159 | |
| 35 mm plates | Fisher NUNC | 153066 | |
| Silicon grease | RS Components Ltd. | RS 494-124 | |
| O-rings | Custom made | ||
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A-7816 | Suggested alternative to custom-made O-rings |
| Microscope | Olympus | IX81 | Inverted microscope |
| Objective | Olympus | UPLSAPO 100XO | N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5 |
| Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600 10B | Progressive scan interline CCD |
| Illuminator | TILL Photonics | Polychrome V | Ultrafast monochromator |
| Incubation chamber | Solent Scientific | Cell^R IX81 | |
| Software | Olympus | SIS xcellence |
References
- Mizushima, N. Autophagy: process and function. Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. The role of Atg proteins in autophagosome formation. Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).
- Klionsky, D. J. Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).
- Klionsky, D. J. Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve. Autophagy. 4, 740-743 (2008).
- Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. 3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum. Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).
- Hayashi-Nishino, M., et al. A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation. Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).
- Lippincott-Schwartz, J. Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*). Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).
- Mizushima, N., et al. Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells. The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).
- Itakura, E., Mizushima, N. Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins. Autophagy. 6, 764-776 (2010).
- Axe, E. L., et al. Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).
- Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue. Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).
