Summary
Time-lapse microscopia di marcatori autofagia fluorescente permette il monitoraggio della risposta autofagia dinamica con alta risoluzione temporale. Utilizzando l'autofagia specifico e marcatori di organelli in una combinazione di 3 colori diversi, siamo in grado di seguire il contributo di una proteina di formazione dell'autofagosoma in un contesto spaziale e temporale robusto.
Abstract
Autofagia è una risposta cellulare innescata dalla mancanza di nutrienti, in particolare l'assenza di amminoacidi. L'autofagia è definita dalla formazione di strutture a doppia membrana, chiamata autophagosomes, che sequestrare il citoplasma, proteine longevi e aggregati proteici, organelli difettosi, e anche virus o batteri. Autophagosomes alla fine si fondono con i lisosomi che portano alla degradazione grosso del loro contenuto, con le sostanze nutritive prodotte essere riciclati al citoplasma. Pertanto, l'autofagia è fondamentale per l'omeostasi cellulare, e la disregolazione di autofagia può portare a malattie, in particolare neurodegenerazione, l'invecchiamento e il cancro.
Formazione dell'autofagosoma è un processo molto elaborato, per cui le cellule hanno assegnato un gruppo specifico di proteine, chiamato il macchinario nucleo autofagia. Il macchinario nucleo autofagia è funzionalmente integrata da proteine addizionali coinvolti in diversi processi cellulari, ad esempio in membrane il traffico, nella biologia dei mitocondri e lisosomi. Il coordinamento di queste proteine per la formazione e la degradazione del autophagosomes costituisce la risposta altamente dinamico e sofisticato di autofagia. Imaging dal vivo cella permette di seguire il contributo molecolare di ogni proteina autofagia correlata al livello di un singolo evento formazione dell'autofagosoma ed in tempo reale, pertanto questa tecnica offre un'alta risoluzione temporale e spaziale.
Qui usiamo una linea di cellule che esprimono stabilmente GFP-DFCP1, per stabilire un contesto spaziale e temporale per la nostra analisi. DFCP1 marchi omegasomes, che sono strutture di precursori che portano alla formazione autophagosomes. Una proteina di interesse (POI) può essere contrassegnato con un rosso o un tag fluorescente ciano. Diversi organelli, come ER, mitocondri ed i lisosomi, sono tutti coinvolti nelle diverse fasi di formazione autofagosoma, e possono essere contrassegnati con un colorante specifico inseguitore. Time-lapse microscopia di AutopHagy in questo set up sperimentale, consente alle informazioni di essere estratto per la quarta dimensione, cioè il tempo. Quindi siamo in grado di seguire il contributo del PDI di autofagia nello spazio e nel tempo.
Introduction
Autofagia è un processo altamente dinamico, che richiede il coordinamento di un gran numero di proteine per l'esito finale della formazione dell'autofagosoma 1-3. Microscopia è probabilmente la tecnica più comunemente applicato per studiare l'autofagia 4. La localizzazione della maggior parte delle proteine autofagia è stata ampiamente studiata in cellule fisse, sia mediante immuno-colorazione, le proteine endogene e dalla espressione della proteina esogena fluorescente tag. Inoltre, la microscopia elettronica (EM), da solo e in combinazione con etichettatura immuno-oro, ha descritto i dettagli particolari di queste strutture 5,6. Nonostante il fatto che queste tecniche hanno stabilito la nostra comprensione della formazione dell'autofagosoma nelle tre dimensioni dello spazio, non sono riusciti a fornire sufficiente quantità di informazioni sulla 4 ° dimensione - tempo. Imaging dal vivo cella supera questa barriera quanto consente seguito alla formazione di un dell'autofagosoma il più vicino possisibile tempo reale 7. Questa tecnica è stato impiegato per studiare l'autofagia da Yoshimori e colleghi 8, ed è stato sempre più utilizzato d'ora in poi.
Microscopia time-lapse cattura la localizzazione del PDI in cellule vive e per un periodo di tempo. Confrontando questi dati con una autofagia ben caratterizzato e / o organelli marcatore, analisi imaging cellulare dal vivo può mettere il POI nel più ampio contesto spaziale e temporale della formazione autofagosoma. Analisi imaging dal vivo cella è basato sulla cattura ripetitiva della localizzazione PDI lungo tutte le fasi di formazione autofagosoma, mentre l'imaging di cellule fissate si basa su una singola acquisizione. Pertanto, l'imaging cellulare dal vivo in grado di dimostrare il contributo del POI in fasi specifiche di formazione autofagosoma, mentre l'imaging di cellule fisse può assumere solo il ruolo di punti di interesse, in base alla sua localizzazione media in molti autophagosomes catturate simultaneamente in diverse fasi della loro lifecyCLE.
Sebbene l'imaging cellulare dal vivo è un metodo di alta potenza analitica, ha alcune limitazioni intrinseche, che dovrebbero essere presi in considerazione. Prima di tutto, di cellule vive richiede l'espressione di una o più proteine esogene fluorescente. Tag fluorescenti tendono ad essere di grandi dimensioni e che a volte possono alterare il comportamento di una proteina per ragioni steriche. Questa situazione è accentuata per proteine di membrana, poichè devono funzionare nello spazio limitato delle dimensioni di 2 membrane. Di nota, autophagosomes sono strutture membranose, e di conseguenza la loro formazione richiede un gran numero di proteine associate alla membrana.
Un'altra serie di problemi è collegata ai livelli di espressione di POI. In linea di principio, una proteina esogena dovrebbe essere espressa a livelli comparabili alla proteina endogena. Questo assicura che importanti regolatori della sua localizzazione sub-cellulare non saranno saturati, e THanalisi e sarà biologicamente rilevanti. Inoltre, la sovraespressione di proteine autofagia dovrebbe essere evitato, come quando sono espresse sopra dei livelli endogeni, tendono a inibire la risposta autofagia 9. Viceversa, poiché i livelli di espressione della PDI dovrebbe essere sufficientemente alta da permettere successivo alla localizzazione per un buon periodo di tempo senza fotometabolismo, un compromesso deve essere raggiunto. Raggiungere i livelli di espressione ottimali di una proteina esogena in cellule di mammiferi richiede un sacco di messa a punto, ma è fattibile attraverso la definizione e lo screening di linee cellulari che esprimono stabilmente diversi livelli del POI.
La risoluzione spaziale che si può ottenere con un microscopio a fluorescenza è un altro fattore limitante. Risoluzione può essere limitata per una serie di ragioni, ma nella migliore risoluzione laterale sarà di circa 250 nm. Ciò significa che gli eventuali oggetti separati da una distanza inferiore a questo appariranno collegato (o come singolaoggetto) e gli oggetti di dimensioni inferiori a 250 nm saranno rappresentati nell'immagine più grande di quello che realmente sono. Quindi le immagini devono essere sempre interpretati con questo in mente e tecniche complementari come EM sarà richiesto di risolvere piccoli dettagli ultra-strutturale.
Infine, di cellule vive richiede intrinsecamente esponendo una cella alla luce, potenzialmente per un periodo prolungato di tempo. Ciò può alterare le risposte fisiologiche di una cellula, un fenomeno noto come foto-tossicità.
Abbiamo utilizzato con successo l'imaging cellulare dal vivo della proteina PI3P vincolante DFCP1 a descrivere per la prima volta che autophagosomes provengono da PI3P ricchi di strutture anulari omegasomes chiamati, che sono in stretta associazione con ER filoni 10,11. Abbiamo chiaramente dimostrato che le strutture LC3-positivi cominciano a formare in stretta associazione con omegasomes. Noi qui suggeriamo che impiegando una linea cellulare che esprime stabilmente GFP-DFCP1 per la cella vivoImaging della proteina di interesse, stabilisce un quadro spaziale e temporale robusto per la caratterizzazione del suo ruolo nella formazione dell'autofagosoma.
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Protocol
1. Preparazione delle cellule
- Seme basso numero di cellule HEK passaggio-293T esprimono stabilmente GFP-DFCP1 on 22 millimetri coprioggetto arrotondato; cellule di coltura durante la notte in mezzo di Dulbecco Modified Eagles (DMEM), ad una confluenza del 30-40% (obiettivo per una confluenza del 80% dopo 2 giorni - giorno di imaging cellulare dal vivo).
2. Trasfezione delle cellule
- Preparare la trasfezione complesso mix per ogni piastra, contenente 100 ml OptiMEM ho ridotto mezzo privo di siero, 3 ml X-tremeGENE 9 DNA Transfezione reagente, e 0,5 mg di pECFP-LC3 DNA plasmidico. Mescolare delicatamente pipettando su e giù e incubare 15 min a temperatura ambiente. [Nota: abbiamo più volte riscontrato che altri reagenti di trasfezione, come Lipofectamine 2000, hanno un sacco di tossicità, e, inoltre, producono particelle fluorescenti per conto proprio che interferiscono con molte tecniche di microscopia.]
- Aspirare il terreno dalle piastre e aggiungere DMEM fresco pre-riscaldato a 37 ° C.
- Aggiungere il transfection complesso di cellule con una pipetta; cellule incubare per 24 ore.
3. L'incubazione delle cellule con il Marker Organelle (Opzionale)
- Aggiungere Mitotracker / Lysotracker a DMEM ad una concentrazione finale di 75 nM, e tenere in ghiaccio, in un tubo falcon coperta con un foglio di alluminio, lungo l'intera giornata sperimentale, per evitare l'esposizione della luce e il congelamento ripetitivo e disgelo.
- Rimuovere una aliquota di 2 ml di Mitotracker / Lysotracker contenenti medio e scaldare a 37 ° C; medie aspirato da cellule transfettate e sostituirlo con Mitotracker / Lysotracker contenenti medio e cellule incubare per 30 - 60 min.
4. Preparazione della camera di incubazione per imaging cellulare dal vivo (Figura 1)
- Pulito metallo e plastica O-ring con il 75% di etanolo e applicare grasso al silicone sul bordo della O-anello metallico.
- Utilizzando pinze rimuovere il vetrino dalla piastra e asciugare l'eccesso di supporto dal lato inferiore del vetrino,per evitare di mescolare troppi media con il grasso, in modo da aumentare la probabilità di perdite.
- Lasciare il vetrino ad appoggiarsi sul davanzale della O-ring in plastica e montare l'O-ring di metallo sopra l'O-ring in plastica, con il coprioggetto inserita tra, al fine di creare una camera chiusa.
- Top up da camera con il supporto dalla piastra, da questo punto in poi, evitare di incubazione prolungata delle cellule in DMEM senza un agente tampone, per evitare variazioni di pH che si verifichi, come il sistema tampone bicarbonato di DMEM richiede la concentrazione di CO 2 artificiale del 5-10% e la concentrazione di CO 2 dell'aria ambiente è molto più basso.
5. La fame di celle
- Mettere la camera di incubazione sul palco microscopio.
- Aspirare il terreno completo e lavare con 2 ml di mezzo inedia 3 volte, per garantire che nessun amminoacidi sono rimasti dal DMEM, che finirà per inibire la risposta autofagia; impostare l'timer ON.
6. Microscopia
- Un sistema di imaging appropriato configurato per vivere cella a grande campo epi-fluorescenza sarà richiesto. Questo in genere comprendono un telaio microscopio invertito ricerca-grado, un intenso ampio spettro sorgente di luce, specchi e filtri specifici per la proteina fluorescente (s) / colorante (s) di interesse, un obiettivo obiettivo di alta qualità, un CCD sensibile / sCMOS fotocamera e una camera di incubazione. Tutti i maggiori produttori offrono sistemi microscopio a largo campo completi adeguata per l'imaging cellulare dal vivo, ma è anche possibile in casa costruire un sistema che utilizza i componenti da una varietà di produttori e controllarlo utilizzando software open source come Micro-Manager ( http: / / valelab.ucsf.edu / ~ MM / MMwiki / ). L'aspetto più importante nel nostro parere è utilizzare un sistema di elevata sensibilità in modo che i livelli di espressione dei reporter fluorescenti possono essere ridotte al minimo.
- Selette le celle appropriate per immagini.
- Selezionare le celle grandi e piatte che permetteranno eventi formativi più autofagosoma per essere catturato. Inoltre, optare per le cellule che hanno già iniziato la produzione di un maggior numero di omegasomes.
- Avviare l'acquisizione video dopo 30 min o anche in risposta autofagia, al fine di acquisire un maggiore rapporto di eventi di formazione autofagosoma al video.
- Imaging.
- Utilizzare una lente ad alto ingrandimento (100x 1.4 NA).
- Regolare l'intensità della luce di eccitazione al 10-20% del massimo per evitare fotometabolismo.
- Impostare la fotocamera (Hamamatsu ORCA ER, dimensione del pixel 6.45 micron) a 100-500 msec esposizione, binning 2x2 e 100 di guadagno.
- Impostare la velocità di acquisizione delle immagini a 1 fotogramma ogni 10 sec.
7. Creazione di montaggi di autofagosoma Formazione Eventi con ImageJ
[Questo può essere fatto in modo non sistematico semplicemente leggendo il video unito per postabocchette di interesse, ma può anche essere sistemato come indicato di seguito.]
- Aperte stack di immagini per il 3 (o 2) catturati canali in ImageJ / Figi.
- Applicare LUT verde, rosso e blu (tabelle di ricerca) per il canale corrispondente; unire 3 colori e risparmiare.
- Dalla scheda Analizza, selezionare Strumenti> ROI direttore ... > Specifica, quindi selezionare una zona casuale di dimensione definita nella prima immagine della pila.
- Nella scheda Immagine, selezionare duplicare, al fine di duplicare l'area selezionata dello stack.
- Nella scheda Immagine, selezionare Stack> Fai fotomontaggio ... per creare un montaggio provvisorio che contiene tutti i fotogrammi catturati. Scansione di tutti i fotogrammi del montaggio per un evento complete formazione dell'autofagosoma; tenere le note del primo e l'ultimo fotogramma della manifestazione.
- Dalla scheda Analizza, selezionare Strumenti> ROI direttore ... selezionare la stessa area nella prima immagine della pila per gli altri due colori, nonché per l'immagine colori fusa e pile duplicato.
- Da tegli scheda File, selezionare Nuovo> Immagine e impostare per la larghezza in base al numero di pixel inizialmente selezionate utilizzando il gestore ROI, fissati per altezza 4 volte l'altezza impostata nel gestore ROI più 3 pixel di spazio tra i 3 colori e le Fette fuse, e impostare come il numero di fotogrammi per ogni stack.
- Nella scheda Immagine, selezionare Stack> Strumenti> Inserisci ..., quindi inserire ognuno sub-stack sopra l'altro, lasciando spazio di 1 pixel in mezzo.
- Nella scheda Immagine, selezionare Stack> Fai fotomontaggio ... per creare un fotomontaggio partendo e terminando con il primo e l'ultimo fotogramma della manifestazione formazione autofagosoma catturato.
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Representative Results
Nel protocollo descritto, abbiamo usato la microscopia time-lapse di seguire la localizzazione di CFP-tag LC3 in una linea di cellule che esprimono stabilmente GFP-tagged DFCP1, in condizioni che inducono autofagia. Il risultato di questo esperimento è la cattura di serie 2 o pile di immagini, uno dal verde e uno del canale blu, corrispondenti a GFP-DFCP1 e CFP-LC3. Abbiamo inoltre analizzato questi video usando ImageJ, al fine di creare montaggi corrispondenti ad eventi di formazione autofagosoma singoli, come descritto nella sezione del protocollo. Questa analisi ci ha permesso di dimostrare che un autofagosoma LC3-positivo proviene da un omegasome DFCP1-positivo. Nel montaggio illustrato in Figura 2, la formazione di un omegasome diventa evidente dal secondo frame, nella forma di una piccola macchia. Il omegasome inizia espansione per formare la caratteristica struttura simile ad anello, e raggiunge il suo diametro massimo dopo 6 min. Successivamente, il omegasome inizia collapsing e alla fine scompare, dopo circa 10 min. Mettendo ora la formazione della struttura LC3-positivi o autophagosome nel contesto della formazione omegasome, osserviamo che la autophagosome appare dopo il omegasome, e diventa chiaramente visibile dopo circa 1,5 min. Il autofagosoma inizia l'espansione in stretta associazione con il omegasome, primo posto e poi l'anello, e quando il omegasome inizia crollare i boccioli autofagosoma off. Alla fine il autofagosoma rimane dietro, a quanto pare di fondersi con i lisosomi, dopo la omegasome scompare. Questa analisi fornisce una chiara indicazione circa la relazione funzionale tra le due strutture, secondo cui LC3 autophagosomes positivi provengono da corrispondenti omegasomes.
In un altro esempio, abbiamo aggiunto un tracker lisosomi, al fine di catturare l'associazione temporale e spaziale del autofagosoma formatura con i lisosomi (Figura 3
Tuttavia, lo stesso tipo di analisi può produrre risultati non interpretabili, a causa di una serie di motivi. Nell'esempio illustrato nella figura 4, i risultati diventano uninterpretable causa di una deriva nel fuoco. Video parte catturando successo la formazione di un autofagosoma tuttavia una deriva a fuoco si verifica dopo il contrassegno 3 min. L'acquisizione video prosegue fuori fuoco per il prossimo 6 minuti, ma alla fine l'attenzione viene corretto manualmente dopo il segno di 9-10 min. Questa analisi, però, rende impossibile discriminare se l'evento formazione dell'autofagosoma catturata quando la messa a fuoco è corretta è laevento iniziale che è quasi completato, o uno nuovo che ha iniziato dopo la deriva nel fuoco.
Ulteriori problemi possono essere attribuiti alla confluenza delle cellule coltivate. Per esempio, quando le cellule sono coltivate a più di confluenza ottimale, sono costretti ad espandere su di una cella adiacente, il che rende concentrandosi molto impegnativo. Inoltre, le cellule che vengono coltivate ad alta confluenza tendono ad essere sottolineato, aumentando i livelli di sfondo attività autofagia prima dell'inizio della fame.
Infine, le questioni legate a fluorescenza sono abbastanza comuni. CFP ha attività fluorescenza più debole rispetto alla GFP, e spesso diventa foto-sbiancato nelle fasi successive del video cattura. L'analisi di tali video può portare a conclusioni negative false circa l'associazione spaziale del POI con autophagosomes formatura. Tuttavia, questi problemi possono essere superati utilizzando una delle varianti come mTurquise2. Un altro phenomeno comunen deriva dal fatto che la fluorescenza di tag rosso non si spegne a pH più basso dei lisosomi. Molte proteine autofagia fisiologicamente finito il loro ciclo di vita all'interno dei lisosomi, mentre autophagosomes alla fine si fondono con i lisosomi. Inoltre, le proteine non funzionali sono spesso presi di mira per la degradazione nei lisosomi. Pertanto, si potrebbe finire dopo la non-correlata associazione di autophagosomes con i lisosomi, invece di una associazione fisica tra un POI e omegasomes rosso-tag.
Figura 1. Camera di incubazione. L'O-ring in plastica si inserisce intorno al bordo del O-ring metallo e ha sul fondo una sporgenza sottile che si estende verso l'interno. Il vetrino viene posizionato sulla sporgenza della O-anello di plastica, e poi la plastica guarnizione è montata sul fondo della O-anello metallico. In questo modo, il coprioggetto è sabbiawiched tra i due O-ring, creando una camera chiusa.
Figura 2. Cellule che esprimono GFP-DFCP1 e CFP-LC3 sono stati a digiuno per 30 minuti e ripreso ad una velocità di 1 fotogramma ogni 10 sec. Un montaggio di un evento rappresentativo autofagosoma formazione è presentato. I segnali provenienti da canali verde e blu sono verdi pseudo-color rosso e corrispondentemente. Le frecce indicano il primo omegasome discernibile e autofagosoma. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Cellule che esprimono GFP-DFCP1 e CFP-LC3, sono stati incubati con Lysotracker rosso, a digiuno per 30 min e ripreso ad una velocità di 1 fotogramma ogni 15 sec. Un montaggio di un evento rappresentativo autofagosoma formazione è presentato. I segnali provenienti da canali verde, rosso e blu sono pseudo-colore verde, blu e rosso corrispondentemente. Le frecce indicano il primo omegasome discernibile e autofagosoma. Punta di freccia indica la prima cattura di fusione autofagosoma con il lisosoma. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 4. Cellule che esprimono GFP-DFCP1 e CFP-LC3 sono stati a digiuno per 30 minuti e ripreso ad una velocità di 1 fotogramma ogni 10 sec. Un montaggio di un esempio di sub-o cattura ptimal è presentato. I segnali provenienti da canali verde e blu sono verdi pseudo-color rosso e corrispondentemente. Le frecce indicano il primo omegasome discernibile e autofagosoma. Clicca qui per ingrandire la figura .
Video 1. Video della manifestazione formazione dell'autofagosoma presentato nella Figura 2. La frequenza di riproduzione è di 4 fotogrammi al secondo. Clicca qui per vedere film .
Video 2. Video dell'evento formazione dell'autofagosoma presentato nella Figura 3. La freccia indica prima, la formazione della omegasome, e la seconda, la fusione del autophagosome con il lisosoma. La frequenza di riproduzione è di 4 fotogrammi al secondo."> Clicca qui per vedere film.
Video 3. Video della manifestazione formazione dell'autofagosoma presentato nella Figura 4. La frequenza di riproduzione è di 4 fotogrammi al secondo. Clicca qui per vedere film .
Tabella 1. Elenco di reagenti e attrezzature specifiche necessarie per il protocollo, insieme con il corrispondente provider e numero di catalogo.
TAMPONI
| Buffer | Composizione | Passo Usato |
| Medie fame | 20 mM HEPES pH 7.4 | 5.2 |
| 140 mM di NaCl | ||
| 1 mM CaCl 2 | ||
| 1 mM MgCl2 | ||
| 5 mM di glucosio | ||
| 1% BSA |
Tabella 2. Elenco di buffer utilizzati in questo protocollo. I tamponi usati, sono elencati loro composizione e il primo passo in cui vengono utilizzati nel protocollo.
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Discussion
Il metodo descritto in questo protocollo permette la visualizzazione di localizzazione di una proteina durante la formazione dell'autofagosoma. Abbiamo provato vari metodi per visualizzare gli eventi descritti anche da punto di scansione confocale, spinning disk confocale e Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopia. Abbiamo trovato che per scopi generali standard wide-field epi-fluorescenza fornisce il miglior compromesso tra sensibilità e risoluzione. Questo assicura buon segnale al rumore, photo-bleaching/photo-toxicity minimo e acquisizione veloce. La mancanza di sezionamento ottico non è un problema se le relative regioni della cella sono scelti per immagine cioè la periferia dove la cella è diffusa e piatta. Tuttavia, è importante che il sistema di imaging utilizzato è opportunamente configurata (sia in termini di hardware utilizzato e le impostazioni di sistema).
Per una migliore risoluzione spaziale, si consiglia di utilizzare un alto ingrandimento, high apertura numerica della lente immersione in olio (lenti ad immersione d'acqua offrono alcun vantaggio di imaging in prossimità del vetrino). Si suggerisce di bilanciare l'intensità di illuminazione (ad esempio con filtri di densità neutri), le impostazioni della fotocamera (tempo di esposizione, binning e guadagno) per massimizzare il rapporto segnale-rumore e minimizzare sbianca. Questo dovrà essere fatto empiricamente, ma come una guida, quando si utilizza un obiettivo 100x 1.4 NA abbiamo in genere ridurre il potere della nostra luce di eccitazione al 10-20% del massimo e impostare la fotocamera (Hamamatsu ORCA ER, dimensione del pixel 6.45 micron) a 100-500 msec esposizione, binning 2x2 e 100 di guadagno.
Il tasso di acquisizione delle immagini deve essere impostata nel range di 1 frame ogni 1-10 sec. L'acquisizione di immagini a frame rate più elevati garantirà una migliore continuità tra le immagini (migliore risoluzione temporale), ma esporrà cellule per più luce e quindi aumentare photo-bleaching/photo-toxicity.
Se l'imaging più fluorescenccanali elettronici, deve essere garantito che il ritardo tra la cattura del canale è ridotto al minimo (ridurre il tempo di esposizione, Fast Fit cambiafiltri). Ciò consentirà di ridurre le probabilità di artefatti da movimento che appaiono nell'immagine composita. Se artefatti di movimento si stanno rivelando difficili da evitare di considerare l'utilizzo di uno splitter immagine (un dispositivo per facilitare l'acquisizione simultanea di due canali di fluorescenza utilizzando una telecamera) o un adattatore dual camera.
Imaging canale blu richiede la selezione di filtri e specchi adatti per evitare cross-emissione della fluorescenza blu al canale verde. Abbiamo utilizzato con successo un CellR microscopio Olympus, che utilizza l'Fino policromo V illuminatore, consentendo specifica selezione di lunghezza d'onda, la larghezza di banda e l'intensità e così è molto flessibile. Tuttavia, la sorgente di luce è 'leaky' con qualche luce bianca proveniente attraverso oltre al wavelengths.For selezionato questo abbiamo montato (multi) filtri passa banda di eccitazione nellacubi, per cui vi è ulteriore filtraggio della luce di eccitazione. La seguente combinazione di specchi / filtri è stato utilizzato (tutto Semrock). Per GFP & mCherry: Exciter FF01-479-585, emettitore FF02-525/40 (GFP) e FF01-607/36 (mCherry), specchi dicroici FF505/606-Di01. Per CFP: Exciter FF01-416/501, emettitore FF01-523/610, specchi dicroici FF440/520-Di01. Abbiamo anche utilizzato un diverso microscopio CellR, che ha dato risultati non ottimali, con cross-emissione di fluorescenza blu al canale verde. Questo microscopio utilizza una sorgente di luce bianca e ha un filtro di ruota veloce per selezionare il wavelengths.This eccitazione significa che la selezione di lunghezza d'onda è limitato alle 8 filtri nella ruota, ma c'è una ruota separato per regolare l'intensità. È stata utilizzata la seguente combinazione di specchi / filtri. Per la GFP (Semrock): Exciter FF01-470/40, emettitore FF02-525/50, specchi dicroici FF495-DI02. Per il CFP e mCherry: Exciter FF01-427/10 (PCP, Semrock) 572/23 (mCherry, Chroma), emettitore FF01-472/30 (CFP, Semrock) 632/60 (mCherry, Chroma), specchi dicroici 89006bs (Chroma).
Il significato di questa tecnica rispetto ad altre tecniche di imaging è duplice: in primo luogo, esso può catturare la localizzazione della proteina di interesse in cellule vive, e la seconda, può aumentare le informazioni estratte aggiungendo la quarta dimensione del tempo. Tuttavia, come per le proteine esogene c'è sempre la possibilità di mislocalization, sia a causa di un aumento dei livelli di espressione o causa di tagging, l'imaging cellulare dal vivo quindi dovrebbe essere combinato con immuno-colorazione del POI endogena in cellule fisse, al fine di confermare i risultati . Infine, è opportuno notare che l'imaging cellulare dal vivo può essere combinato con immuno-EM, al fine di aumentare la risoluzione spaziale dell'analisi.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Il nostro lavoro è supportato dal Biotecnologie e Scienze Biologiche Research Council. Vorremmo ringraziare il Prof Tamotsu Yoshimori per la gentile fornitura di noi con il plasmide per l'espressione di CFP-LC3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 41965 | |
| OptiMEM I | Invitrogen | 31985-062 | |
| MitoTracker Red FM | Invitrogen | M22425 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 | |
| X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche Applied Science | 6365787001 | |
| 22 mm coverslips | VWR | 631-0159 | |
| 35 mm plates | Fisher NUNC | 153066 | |
| Silicon grease | RS Components Ltd. | RS 494-124 | |
| O-rings | Custom made | ||
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A-7816 | Suggested alternative to custom-made O-rings |
| Microscope | Olympus | IX81 | Inverted microscope |
| Objective | Olympus | UPLSAPO 100XO | N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5 |
| Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600 10B | Progressive scan interline CCD |
| Illuminator | TILL Photonics | Polychrome V | Ultrafast monochromator |
| Incubation chamber | Solent Scientific | Cell^R IX81 | |
| Software | Olympus | SIS xcellence |
References
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