Live cell imaging van Vroege Autophagy Evenementen: Omegasomes en Beyond
Summary
Time-lapse microscopie van fluorescent gelabelde autofagie markers zorgt voor de opvolging van de dynamische autofagie respons met een hoge temporele resolutie. Met specifieke autofagie en organel markers in een combinatie van 3 verschillende kleuren, kunnen we de bijdrage van een eiwit autophagosome vorming in een robuuste ruimtelijke en temporele context volgen.
Abstract
Autofagie cellulaire respons veroorzaakt door het gebrek aan voedingsstoffen, in het bijzonder de afwezigheid van aminozuren. Autophagy wordt bepaald door de vorming van een dubbele membraan structuren genaamd autophagosomes dat cytoplasma, langlevende eiwitten en eiwitcomplexen, defecte organellen, en zelfs virussen of bacteriën sekwestreren. Autofagosomen uiteindelijk fuseren met lysosomen leidt tot bulk degradatie van de inhoud, met de geproduceerde voedingsstoffen worden teruggevoerd naar het cytoplasma. Daarom autofagie is cruciaal voor cel homeostase, en ontregeling van autofagie kan leiden tot ziekte, met name neurodegeneratie, veroudering en kanker.
Autophagosome formatie is een uitgebreid proces, waarbij cellen van een bepaalde groep eiwitten, de zogenaamde kern autophagy machines toegewezen. De kern autofagie machines wordt functioneel aangevuld met extra eiwitten betrokken bij diverse cellulaire processen, bijvoorbeeld in membrane mensenhandel, in het mitochondriaal en lysosomale biologie. Coördinatie van deze eiwitten voor de vorming en afbraak van autofagosomen vormt de zeer dynamische en verfijnde respons van autofagie. Live cell imaging maakt het mogelijk om de moleculaire bijdrage van elke autofagie-gerelateerd eiwit volgen tot op het niveau van een enkele autophagosome formatie evenement en in real-time, dus deze techniek biedt een hoge temporele en ruimtelijke resolutie.
Hier gebruiken we een cellijn stabiel tot expressie GFP-DFCP1, een ruimtelijke en temporele context voor onze analyse vast te stellen. DFCP1 merken omegasomes, die voorloper structuren die leiden tot autofagosomen vorming zijn. Een eiwit van interesse (POI) kan worden gemarkeerd met een rood of cyaan fluorescente label. Verschillende organellen, zoals het ER, mitochondria en lysosomen, zijn allemaal betrokken bij verschillende stappen van autophagosome vorming en kan worden gekleurd met een specifiek tracker kleurstof. Time-lapse microscopie van AutopHagy in deze experimentele opstelling, waarmee informatie kan worden afgeleid omtrent de vierde dimensie, dat wil zeggen de tijd. Dus kunnen we de bijdrage van de POI te autofagie in ruimte en tijd te volgen.
Introduction
Autofagie is een zeer dynamisch proces, waarbij de coördinatie van een groot aantal eiwitten voor het uiteindelijke resultaat van autophagosome formatie 1-3 vereist. Microscopie is waarschijnlijk de meest toegepaste techniek voor het bestuderen van autofagie 4. De lokalisatie van de meeste autophagy eiwitten is uitgebreid bestudeerd in gefixeerde cellen, zowel immuno-kleuring de endogene eiwitten en door expressie van fluorescent gelabeld exogeen eiwit. Bovendien heeft Elektronenmicroscopie (EM), alleen en in combinatie met immuno-goud labeling, beschreef de fijne details van deze structuren 5,6. Hoewel deze technieken ons begrip van autophagosome formatie in de 3 dimensies van ruimte hebben vastgesteld, hebben zij niet voldoende informatie over de 4e dimensie te geven – time. Live cell imaging overwint deze barrière moet het mogelijk worden na de vorming van een autophagosome zo dicht mogeble om real-time 7. Deze techniek werd voor het eerst gebruikt om autofagie studeren door Yoshimori en collega 8, en in toenemende mate voortaan gebruikt.
Time-lapse microscopie vangt de lokalisatie van de POI in levende cellen en over een periode van tijd. Door deze informatie te vergelijken met een goed gekarakteriseerd autofagie en / of organel marker, kan live cell imaging analyse de POI zetten in de grotere ruimtelijke en temporele context van autophagosome formatie. Live cell imaging analyse zijn de repetitieve vastleggen van de POI lokalisatie langs alle stappen autophagosome vorming, terwijl beeldvorming van gefixeerde cellen is gebaseerd op een opname. Daarom kan live cell imaging van de bijdrage van de POI op specifieke stappen van autophagosome vorming te bewijzen, terwijl de beeldvorming van vaste cellen alleen de rol van de NP, op basis van haar gemiddelde lokalisatie in vele autofagosomen tegelijk gevangen in verschillende stadia van hun lifecy kunnen aannemencle.
Hoewel live cell imaging is een methode van hoog analytisch vermogen, het heeft een aantal inherente beperkingen, die in aanmerking moeten worden genomen. Allereerst live cell imaging vereist de expressie van een of meer exogene fluorescent gelabelde eiwitten. Fluorescentielabels neiging groot in omvang zijn en ze soms gevolgen voor de werking van een eiwit door sterische redenen. Deze situatie wordt geaccentueerd voor membraaneiwitten, omdat deze de functie in de beperkte ruimte van de 2 dimensies van membranen. Opmerkelijk, autophagosomes zijn vliezige structuren en derhalve hun vorming vereist een groot aantal membraan-geassocieerde eiwitten.
Een andere reeks problemen verbonden met het expressieniveau van de POI. In principe moet een exogeen proteïne expressie op niveaus vergelijkbaar met de endogene proteïne. Dit zorgt ervoor dat belangrijke regulatoren van de sub-cellulaire lokalisatie niet worden verzadigd, en the analyse biologisch relevant. Bovendien moet overexpressie van autofagie eiwitten worden vermeden, wanneer daarbij de endogene niveaus worden uitgedrukt, zij meestal autophagy reactie 9 remmen. Omgekeerd, omdat de expressieniveaus van de NP moet hoog genoeg zijn om na de lokalisatie voor een goede tijd toe te laten zonder fotoblekingsreactie zijn, een compromis worden bereikt. Het bereiken van de optimale expressie van een exogeen eiwit in zoogdieren cellen vergt veel afstemming, maar het is haalbaar door de oprichting en het screenen van cellijnen stabiel tot expressie verschillende niveaus van de POI.
De ruimtelijke resolutie die met conventionele fluorescentiemicroscopie kan worden bereikt, is een beperkende factor. Resolutie is afhankelijk van een aantal redenen, maar hoogstens zal laterale resolutie rond 250 nm. Dit betekent dat alle objecten op een afstand kleiner dan verschijnt dit verbonden (of als eenobject) en objecten kleiner dan 250 nm zal in het beeld groter dan ze in werkelijkheid zijn vertegenwoordigd. Daarom afbeeldingen moet altijd worden geïnterpreteerd met dit in gedachten en complementaire technieken zoals EM vereist zal zijn om fijne ultra-structurele detail te lossen.
Tenslotte live cell imaging inherent vereist blootstellen van een cel aan licht, mogelijk gedurende een langere tijdsperiode. Dit kan de fysiologische reacties van een cel, een verschijnsel bekend als foto-toxiciteit veranderen.
We hebben met succes gebruik live cell imaging van de PI3P-bindende eiwit DFCP1 te beschrijven voor het eerst dat autofagosomen afkomstig zijn van PI3P-rijk ring-achtige structuren genoemd omegasomes, die in nauwe samenwerking met ER strengen 10,11. We hebben duidelijk aangetoond dat LC3-positieve structuren te starten waarbij in nauwe samenwerking met omegasomes. Wij hier suggereren dat het gebruik van een cellijn stabiel tot expressie GFP-DFCP1 voor de levende celbeeldvorming van het eiwit van belang, wordt een robuuste ruimtelijke en temporele frame voor de karakterisering van zijn rol in autophagosome formatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De methode beschreven in dit protocol kan de visualisatie van de lokalisatie van een eiwit tijdens autophagosome formatie. We hebben geprobeerd verschillende methoden van het visualiseren van de gebeurtenissen beschreven, waaronder point-scanning confocale, spinning disk confocale en Total Internal Reflection Fluorescentie (TIRF) microscopie. Wij hebben geconstateerd dat voor algemene doeleinden standaard wide-field epi-fluorescentie biedt het beste compromis tussen gevoeligheid en resolutie. Dit zorgt voor een goede si…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ons werk wordt ondersteund door de Biologie en Biotechnologie Sciences Research Council. Wij willen graag Prof Tamotsu Yoshimori bedanken voor vriendelijk ons te voorzien van de plasmide voor de expressie van de GVB-LC3.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 41965 | |
| OptiMEM I | Invitrogen | 31985-062 | |
| MitoTracker Red FM | Invitrogen | M22425 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 | |
| X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche Applied Science | 6365787001 | |
| 22 mm coverslips | VWR | 631-0159 | |
| 35 mm plates | Fisher NUNC | 153066 | |
| Silicon grease | RS Components Ltd. | RS 494-124 | |
| O-rings | Custom made | ||
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A-7816 | Suggested alternative to custom-made O-rings |
| Microscope | Olympus | IX81 | Inverted microscope |
| Objective | Olympus | UPLSAPO 100XO | N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5 |
| Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600 10B | Progressive scan interline CCD |
| Illuminator | TILL Photonics | Polychrome V | Ultrafast monochromator |
| Incubation chamber | Solent Scientific | Cell^R IX81 | |
| Software | Olympus | SIS xcellence |
References
- Mizushima, N. Autophagy: process and function. Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. The role of Atg proteins in autophagosome formation. Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).
- Klionsky, D. J. Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).
- Klionsky, D. J. Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve. Autophagy. 4, 740-743 (2008).
- Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. 3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum. Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).
- Hayashi-Nishino, M., et al. A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation. Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).
- Lippincott-Schwartz, J. Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*). Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).
- Mizushima, N., et al. Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells. The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).
- Itakura, E., Mizushima, N. Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins. Autophagy. 6, 764-776 (2010).
- Axe, E. L., et al. Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).
- Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue. Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).
