Leve Cell Imaging av Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond
Summary
Time-lapse mikroskopi av fluorescensmerkede autophagy markører tillater overvåking av den dynamiske autophagy respons med høy tidsmessig oppløsning. Ved hjelp av spesifikke autofagi og organellesystemer markører i en kombinasjon av tre forskjellige farger, kan vi følge bidraget av et protein til autophagosome formasjonen i en robust romlig og tidsmessig sammenheng.
Abstract
Autophagy er en cellulær respons som utløses av mangel på næringsstoffer, særlig fraværet av aminosyrer. Autophagy er definert ved dannelsen av dobbel membran struktur, kalt autophagosomes, som binder cytoplasma, langlivede proteiner og protein aggregater, defekte organeller, og selv virus eller bakterier. Autophagosomes til slutt satt sammen med lysosomer fører til bulk nedbrytning av sitt innhold, med de produserte næringsstoffer blir resirkulert tilbake til cytoplasma. Derfor er autofagi avgjørende for celle homeostase, og feilregulering av autofagi kan føre til sykdom, spesielt nevrodegenerasjon, aldring og kreft.
Autophagosome formasjonen er en svært omfattende prosess, der cellene har tildelt en bestemt gruppe proteiner som kalles kjernen autophagy maskiner. Kjernen autophagy maskiner er funksjonelt supplert med ekstra proteiner som er involvert i ulike cellulære prosesser, for eksempel i membrane menneskehandel, i mitokondrie og lysosomale biologi. Koordinering av disse proteinene for dannelse og nedbrytning av autophagosomes utgjør høyst sofistikert og dynamisk respons av autophagy. Sanntids avbildning celle gjør det mulig å følge den molekylære bidraget fra hver autophagy-relatert protein ned til nivået for en enkelt autophagosome formasjon arrangement og i sann tid, og derfor denne teknikken gir en høyere tids-og romlig oppløsning.
Her bruker vi en cellelinje stabilt uttrykker GFP-DFCP1, for å etablere en romlig og tidsmessig sammenheng for vår analyse. DFCP1 merker omegasomes, som er forløperen strukturer som fører til autophagosomes formasjon. Et protein av interesse (POI) kan merkes med enten en rød eller cyan fluorescerende tag. Ulike organeller, som ER, mitokondrier og lysosomer, er alle involvert i ulike trinn av autophagosome formasjon, og kan merkes ved hjelp av en bestemt tracker fargestoff. Time-lapse mikroskopi av AUTOPHagy i denne eksperimentelle oppsettet, gjør at informasjon som hentes ut om den fjerde dimensjon, dvs. tid. Derfor kan vi følge bidraget av POI til autophagy i rom og tid.
Introduction
Autophagy er et høyt dynamisk prosess, som krever koordinering av et stort antall proteiner for det endelige resultat av autophagosome formasjon 1-3. Mikroskopi er trolig den teknikken som oftest brukt for å studere autophagy fire. Lokalisering av de fleste autophagy proteiner har blitt grundig studert i faste celler, både ved immuno-farging de endogene proteiner og ved uttrykk for fluorescently merket eksogene protein. I tillegg har Electron Microscopy (EM), alene og i kombinasjon med immuno-gull merking, beskrives de fine detaljene i disse strukturene 5,6. Til tross for at disse teknikkene har etablert vår forståelse av autophagosome formasjonen i de tre dimensjonene av plass, har de unnlatt å gi tilstrekkelig mengde informasjon om den 4. dimensjon – tid. Live-cell imaging overvinner denne barrieren som gjør det mulig å følge dannelsen av en autophagosome så nær som muBle å sanntid 7. Denne teknikken ble først ansatt for å studere autofagi av Yoshimori og kolleger 8, og har blitt stadig mer brukt nå av.
Time-lapse mikroskopi fanger lokalisering av POI i levende celler og over en tidsperiode. Ved å sammenligne denne informasjonen med en godt karakterisert autofagi og / eller organeller markør, kan levende celle bildebehandling analyse sette POI i større romlig og tidsmessig sammenheng med autophagosome formasjon. Live-cell imaging Analysen er basert på repeterende fangst av POI lokalisering langs alle trinnene autophagosome formasjon, mens avbildning av faste celler er basert på en enkelt fangst. Derfor kan levende celle bildebehandling bevise at bidraget fra POI på bestemte trinn på autophagosome formasjon, mens avbildning av faste celler kan bare anta rollen som POI, basert på gjennomsnittlig lokalisering i mange autophagosomes samtidig fanget på ulike stadier av lifecy derescle.
Selv om levende celle bildebehandling er en metode for høy analytisk kraft, har det noen iboende begrensninger, som bør tas i betraktning. For det første krever levende celle avbildning ekspresjonen av ett eller flere eksogene fluorescensmerkede proteiner. Fluorescerende koder en tendens til å bli store i størrelse, og de kan noen ganger endre oppførselen til et protein på grunn av steriske grunner. Denne situasjonen er fremhevet for membranproteiner, som de trenger for å fungere i det begrensede området i to dimensjoner av membraner. Til opplysning, autophagosomes er membran-strukturer, og følgelig deres dannelse krever et stort antall membran-assosierte proteiner.
Et annet sett av problemer er knyttet til uttrykket nivåer av POI. I prinsippet skal et eksogent protein uttrykkes ved nivåer sammenlignbare med det endogene protein. Dette sikrer at viktige regulatorer av sin sub-cellulær lokalisering vil ikke bli mettet, og the analysen vil være biologisk relevant. Videre bør overekspresjon av proteinene autophagy unngås, som når de blir uttrykt over det endogene nivået, har de en tendens til å inhibere responsen autophagy 9.. Omvendt skal ettersom uttrykket nivåer av POI være høy nok til å tillate etter at den er lokalisert til en god periode uten foto-bleking, er et kompromiss for å nås. Oppnå den optimale uttrykk nivåer av et eksogent protein i pattedyr celler krever mye finjustering, men det er mulig ved å etablere og screening cellelinjer stabilt uttrykker ulike nivåer av POI.
Den romlig oppløsning som kan oppnås med standard fluorescens mikroskopi er en annen begrensende faktor. Oppløsning kan være begrenset av en rekke grunner, men i beste fall vil lateral oppløsning være rundt 250 nm. Dette betyr at eventuelle gjenstander adskilt med en avstand som er mindre enn dette vil vises koblet til (eller som en enkeltobjektet) og objekter som er mindre enn 250 nm vil være representert i bildet større enn de faktisk er. Derfor bildene skal alltid tolkes med dette i tankene og komplementære teknikker som EM vil være nødvendig for å løse fin ultra-strukturelle detaljer.
Endelig krever levende celle avbildning iboende eksponere en celle for lys, eventuelt i en lengre tidsperiode. Dette kan endre de fysiologiske responser i en celle, et fenomen kjent som foto-toksisitet.
Vi har med hell brukt levende celle avbildning av PI3P-bindende protein DFCP1 å beskrive for første gang at autophagosomes stammer fra PI3P-rik ring-lignende strukturer kalt omegasomes, som er i nært samarbeid med ER tråder 10,11. Vi har klart vist at LC3-positive strukturer begynne å danne i nært samarbeid med omegasomes. Vi her tyder på at ansette en cellelinje stabilt uttrykker GFP-DFCP1 for live cellavbildning av protein av interesse, etablerer et robust romlig og tidsmessig ramme for karakterisering av sin rolle i autophagosome formasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden som beskrives i denne protokollen tillater visualisering av et protein lokalisering under autophagosome formasjon. Vi har prøvd ulike metoder for å visualisere hendelsene beskrevet inkludert point-skanning confocal, spinning disk confocal og Total Internal Reflection fluorescens (TIRF) mikroskopi. Vi har funnet at for generelle formål standard bredt felt epi-fluorescens gir det beste kompromiss mellom sensitivitet og oppløsning. Dette sikrer godt signal til støy, minimal photo-bleaching/photo-toxicity og ra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vårt arbeid er støttet av bioteknologi og Biological Sciences Research Council. Vi ønsker å takke Prof Tamotsu Yoshimori for vennlig forsyne oss med plasmidet for uttrykket av CFP-LC3.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 41965 | |
| OptiMEM I | Invitrogen | 31985-062 | |
| MitoTracker Red FM | Invitrogen | M22425 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 | |
| X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche Applied Science | 6365787001 | |
| 22 mm coverslips | VWR | 631-0159 | |
| 35 mm plates | Fisher NUNC | 153066 | |
| Silicon grease | RS Components Ltd. | RS 494-124 | |
| O-rings | Custom made | ||
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A-7816 | Suggested alternative to custom-made O-rings |
| Microscope | Olympus | IX81 | Inverted microscope |
| Objective | Olympus | UPLSAPO 100XO | N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5 |
| Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600 10B | Progressive scan interline CCD |
| Illuminator | TILL Photonics | Polychrome V | Ultrafast monochromator |
| Incubation chamber | Solent Scientific | Cell^R IX81 | |
| Software | Olympus | SIS xcellence |
References
- Mizushima, N. Autophagy: process and function. Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. The role of Atg proteins in autophagosome formation. Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).
- Klionsky, D. J. Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).
- Klionsky, D. J. Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve. Autophagy. 4, 740-743 (2008).
- Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. 3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum. Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).
- Hayashi-Nishino, M., et al. A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation. Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).
- Lippincott-Schwartz, J. Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*). Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).
- Mizushima, N., et al. Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells. The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).
- Itakura, E., Mizushima, N. Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins. Autophagy. 6, 764-776 (2010).
- Axe, E. L., et al. Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).
- Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue. Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).
