Levande cell imaging av Early autophagy Evenemang: Omegasomes och Beyond
Summary
Time-lapse mikroskopi av fluorescerande autophagy markörer medger övervakning av den dynamiska autophagy svar med hög tidsupplösning. Använda specifik autophagy och organell markörer i en kombination av tre olika färger, kan vi följa bidrag av ett protein till autophagosome bildning i en robust rumsliga och tidsmässiga sammanhang.
Abstract
Autophagy är en cellulär reaktion utlöst av brist på näringsämnen, speciellt frånvaron av aminosyror. Autophagy definieras genom bildning av dubbla membranstrukturer, som kallas autophagosomes, som sekvestrerar cytoplasman, långlivade proteiner och aggregat protein, defekta organeller, och även virus eller bakterier. Autophagosomes smälter så småningom med lysosomer som leder till bulk nedbrytning av deras innehåll, med de producerade näringsämnen återvinns tillbaka till cytoplasman. Därför är autophagy avgörande för cell homeostas, och oregelbundenhet i autophagy kan leda till sjukdom, främst neurodegeneration, åldrande och cancer.
Autophagosome formation är en mycket komplicerad process, för vilken celler har tilldelats en specifik grupp av proteiner, som kallas maskiner kärnan autophagy. Kärnan autophagy maskiner är funktionellt kompletteras med ytterligare proteiner involverade i olika cellulära processer, t.ex. i membrane handel, i mitokondrie och lysosomala biologin. Samordning av dessa proteiner för bildning och nedbrytning av autophagosomes utgör den mycket dynamiska och sofistikerade svar autophagy. Live cell imaging gör att man kan följa den molekylära bidraget från varje autophagy-relaterat protein ned till nivån av ett enda autophagosome formation händelse och i realtid, därför denna teknik erbjuder en hög temporal och spatial upplösning.
Här använder vi en cellinje stabilt uttrycker GFP-DFCP1, att upprätta en rumsliga och tidsmässiga sammanhang för vår analys. DFCP1 märken omegasomes, som är prekursor strukturer leder till autophagosomes bildning. Ett protein av intresse (POI) kan markeras med antingen en röd eller cyanfluorescerande taggen. Olika organeller, såsom ER, mitokondrier och lysosomer, är alla involverade i olika steg av autophagosome formation, och kan märkas med en specifik tracker färgämne. Time-lapse mikroskopi av AutopHagy i denna experimentella upplägg, gör att information kan extraheras om den fjärde dimensionen, dvs tid. Därför kan vi följa bidrag POI att autophagy i tid och rum.
Introduction
Autophagy är en mycket dynamisk process, som kräver samordning av ett stort antal proteiner för det slutliga resultatet av autophagosome formation 1-3. Mikroskopi är förmodligen den teknik som oftast tillämpas för att studera autophagy 4. Lokaliseringen av de flesta autophagy proteiner har studerats i fixerade celler, både av immuno-färgning av de endogena proteiner och genom uttryck av fluorescensmärkta exogena proteinet. Dessutom har elektronmikroskopi (EM), enbart och i kombination med immun-guld märkning, beskrivs de fina detaljerna i dessa strukturer 5,6. Trots att dessa tekniker har etablerat vår förståelse av autophagosome bildning i de tre dimensionerna av utrymmet, har de misslyckats med att ge tillräcklig mängd information om den 4: e dimensionen – tiden. Live cell imaging övervinner denna barriär eftersom det tillåter efter bildandet av en autophagosome så nära som möjlig till realtid 7. Denna teknik användes först för att studera autophagy av Yoshimori och kollegor 8, och har blivit allt vanligare framöver.
Time-lapse mikroskopi fångar lokalisering av POI i levande celler och över en tidsperiod. Genom att jämföra denna information med en väl karakteriserad autophagy och / eller organell markör, kan levande cell imaging analys sätta POI i större rumsliga och tidsmässiga sammanhang autophagosome formation. Live-cell imaging analys bygger på repetitiva infångandet av POI lokalisering längs alla stegen autophagosome formation, medan avbildning av fasta celler är baserad på en enda fångst. Därför kan levande cell imaging bevisa bidrag POI vid specifika steg autophagosome formation, medan avbildning av fasta celler kan bara anta rollen av POI, baserat på dess genomsnittliga lokalisering i många autophagosomes samtidigt fångade i olika skeden av deras lifecykel.
Även levande cell imaging är en metod för hög analytisk kraft, den har vissa inneboende begränsningar, vilket bör beaktas. Först av allt kräver levande cell imaging uttrycket av en eller flera exogena fluorescensmärkta proteiner. Fluorescerande markörer tenderar att vara stora i storlek och de kan ibland förändra beteendet hos ett protein på grund av steriska skäl. Denna situation accentueras för membranproteiner, som de behöver för att fungera i det begränsade utrymmet i de två dimensionerna av membran. Av notera, autophagosomes är membranstrukturer, och följaktligen deras bildning kräver ett stort antal membran-associerade proteiner.
En annan uppsättning problem är ansluten till uttryck nivåer av POI. I princip bör ett exogent protein att uttryckas vid nivåer som är jämförbara med det endogena proteinet. Detta säkerställer att viktiga regulatorer av dess sub-cellulär lokalisering inte kommer vara mättad, och the Analysen kommer att vara biologiskt relevant. Dessutom bör överuttryck av autophagy proteiner undvikas, som när de uttrycks ovan de endogena nivåerna, de tenderar att hämma autophagy respons 9. Omvänt bör eftersom expressionsnivåer av POI vara hög nog för att tillåta efter dess lokalisering för en god tid utan foto-blekning, har en kompromiss som skall uppnås. Att uppnå optimalt uttryck nivåer av ett exogent protein i däggdjur celler kräver en hel del finjusteringar, men det är möjligt genom upprättande och screening cellinjer som stabilt uttrycker olika nivåer av POI.
Den rumsliga upplösningen som kan uppnås med standard fluorescensmikroskopi är en annan begränsande faktor. Upplösning kan begränsas av ett antal skäl, men i bästa fall, kommer sidoupplösning vara runt 250 nm. Detta innebär att alla objekt separerade med ett avstånd som är mindre än detta kommer att visas ansluten (eller som en endaobjekt) och objekt som är mindre än 250 nm kommer att vara representerade i bilden större än de egentligen är. Därför bilderna bör alltid tolkas med detta i åtanke och komplementära metoder såsom EM kommer att krävas för att lösa fina ultra-strukturell detalj.
Slutligen kräver levande cell imaging inneboende utsätta en cell för ljus, eventuellt under en längre tid. Detta kan förändra de fysiologiska svaren hos en cell, ett fenomen som kallas foto-toxicitet.
Vi har framgångsrikt använt levande cell avbildning av PI3P-bindande proteinet DFCP1 att beskriva för första gången att autophagosomes härrör från PI3P-rika ringliknande strukturer benämnda omegasomes, som är i nära anslutning till ER strängarna 10,11. Vi har tydligt visat att LC3-positiva strukturer börjar bildas i nära samarbete med omegasomes. Vi föreslår här att använda en cellinje som stabilt uttrycker GFP-DFCP1 för den levande cellenavbildning av proteinet av intresse, upprättas en robust spatial och temporal ram för karakterisering av dess roll i autophagosome formation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den metod som beskrivs i detta protokoll möjliggör visualisering av ett proteins lokalisering under autophagosome formation. Vi har provat olika metoder för att visualisera händelserna beskrivas inklusive punkt-konfokala, spinning disk konfokala och total intern reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi. Vi har funnit att för allmänna ändamål standard brett fält epi-fluorescens ger den bästa kompromissen mellan känslighet och upplösning. Detta säkerställer god signal till brus, minimal photo-bleaching/photo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vårt arbete stöds av bioteknik och Biological Sciences Research Council. Vi vill tacka Prof Tamotsu Yoshimori för vänligt förse oss med plasmiden för uttryck av GFP-LC3.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 41965 | |
| OptiMEM I | Invitrogen | 31985-062 | |
| MitoTracker Red FM | Invitrogen | M22425 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 | |
| X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche Applied Science | 6365787001 | |
| 22 mm coverslips | VWR | 631-0159 | |
| 35 mm plates | Fisher NUNC | 153066 | |
| Silicon grease | RS Components Ltd. | RS 494-124 | |
| O-rings | Custom made | ||
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A-7816 | Suggested alternative to custom-made O-rings |
| Microscope | Olympus | IX81 | Inverted microscope |
| Objective | Olympus | UPLSAPO 100XO | N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5 |
| Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600 10B | Progressive scan interline CCD |
| Illuminator | TILL Photonics | Polychrome V | Ultrafast monochromator |
| Incubation chamber | Solent Scientific | Cell^R IX81 | |
| Software | Olympus | SIS xcellence |
References
- Mizushima, N. Autophagy: process and function. Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. The role of Atg proteins in autophagosome formation. Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).
- Klionsky, D. J. Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).
- Klionsky, D. J. Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve. Autophagy. 4, 740-743 (2008).
- Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. 3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum. Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).
- Hayashi-Nishino, M., et al. A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation. Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).
- Lippincott-Schwartz, J. Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*). Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).
- Mizushima, N., et al. Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells. The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).
- Itakura, E., Mizushima, N. Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins. Autophagy. 6, 764-776 (2010).
- Axe, E. L., et al. Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).
- Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue. Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).
