L'aterosclerosi è un processo infiammatorio cronico. Questo manoscritto illustra un facile da usare ex vivo modello per studiare carotidea fresco o placche coronariche. Il modello ex vivo permette la ricerca di sostanze potenziali sul milieu infiammatoria nelle lesioni aterosclerotiche umane ed i risultati possono essere analizzati con vari metodi.
L'aterosclerosi è una malattia infiammatoria cronica del sistema vascolare. Ci sono vari metodi per studiare il composto infiammatoria nelle lesioni aterosclerotiche. Modelli murini sono uno strumento importante per studiare i processi infiammatori in atherogenesis, ma questi modelli soffrono di differenze fenotipiche e funzionali tra il topo e il sistema immunitario umano. Gli esperimenti in vitro di cellule sono utilizzate per valutare specificamente cellulari variazioni a seconda del tipo causati da una sostanza di interesse, ma le variazioni coltura-dipendenti e l'incapacità di analizzare l'influenza delle molecole specifiche nel contesto del composto infiammatoria nelle lesioni aterosclerotiche limitano l'impatto dei risultati. Inoltre, i livelli di una molecola di interesse nel sangue umano misurazione aiuta a indagare ulteriormente la sua rilevanza clinica, ma questo rappresenta infiammazione sistemica e non locale. Pertanto, qui descriviamo un modello di coltura placca studiare lesione aterosclerotica biologia umanaex vivo. In breve, le placche freschi sono ottenuti da pazienti sottoposti ad endoarterectomia o bypass aorto-coronarico e conservati in mezzo RPMI sul ghiaccio fino al loro utilizzo. I campioni vengono tagliati in piccoli pezzi seguite da distribuzione casuale in una piastra a 48 pozzetti, contenente RPMI oltre ad una sostanza di interesse quali citochine o chemochine soli o in combinazione, per periodi di tempo definiti. Dopo l'incubazione, i pezzi di placca possono essere scossa congelati per l'isolamento di mRNA, inclusi in paraffina o ottobre per la colorazione immunoistochimica o distrutte e lisate per western blotting. Inoltre, le cellule possono essere isolate dalla placca per l'analisi di citometria a flusso. Inoltre, surnatanti possono essere raccolti per la misurazione delle proteine mediante ELISA. In conclusione, la ex vivo modello presentato apre la possibilità di studiare ulteriormente infiammatoria biologia lesionale, che può provocare l'identificazione di meccanismi di malattia romanzo e bersagli terapeutici.
Aterosclerosi come una malattia infiammatoria cronica è una delle principali cause di morte nei paesi industrializzati 1-2. Complicazioni di aterosclerosi, sindromi coronariche acute in particolare, sono stati collegati alla rottura delle lesioni vulnerabili, causando aterotrombosi e all'occlusione del vaso 3. L'immunità innata e adattativa sembra essere coinvolto in tutte le fasi atherogenesis 2,4-5. Anche se sono stati compiuti progressi significativi nel trattamento dell'infarto miocardico, un'efficace prevenzione di aterosclerosi e di eventi cardiovascolari avversi sono ancora irrisolti. Così, lo studio della biologia lesionale è essenziale per aumentare le nostre conoscenze sulla fisiopatologia di aterosclerosi e per consentire l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici e lo sviluppo di nuove terapie.
In molti casi, i modelli murini sono usati per studiare la fisiopatologia di malattie specifiche. Tuttavia, lo studio atherogenesis utilizzando modelli murini è accompanied da diverse limitazioni: (1) Di solito, i topi aterosclerotiche ricevono una dieta ricca di colesterolo. I livelli di colesterolo in questi modelli non possono essere confrontati con quelli in pazienti con elevati livelli sierici di colesterolo 6. (2) Ci sono differenze sostanziali tra il topo e il sistema immunitario umano; così FOXP3 è un marcatore specifico delle cellule T regolatorie murine, mentre l'espressione umana FOXP3 nelle cellule T umane non necessariamente conferisce un fenotipo regolamentazione 7. Inoltre, il paradigma Th1/Th2 come definito negli esseri umani non è completamente trasferibile a cellule T murine. (3) Un numero di marcatori che vengono utilizzati per identificare monociti e macrofagi murini come F4/80 e marcatori di classica (M1) vs alternativa (M2) pattern di attivazione non esiste in cellule mieloidi umane 8. (4) L'espressione genica di monociti del sangue periferico murini e umani è stato trovato per essere sostanzialmente differente 9.
Pertanto, al fine di aumentare la comprensione delleprocessi infiammatori cronici in aterosclerosi umana, abbiamo bisogno di fare uso di modelli di lavoro con i tessuti umani, sangue o cellule. Qui, descriviamo un modello di coltura tissutale placca umana, che permette il rilevamento di eventuali sostanze romanzo nel concetto di biologia lesionale infiammatoria umana.
Qui vi presentiamo un ex vivo placca modello di coltura per studiare l'influenza di sostanze potenzialmente rilevanti sul aterosclerotica lesione biologia. Il principale vantaggio di questo metodo ex vivo è la capacità di valutare l'influenza delle sostanze indicate sulle cellule infiammatorie e la loro interazione cellulare nonché vie infiammatorie e cascate all'interno lesioni aterosclerotiche umane. Diversi metodi utilizzabili (es. RT-PCR, western blot, immunoistochimica, cit…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Nadine Wambsganss per l'eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) ER 682/2-1 e uno stipendio di ricerca dalla Società Tedesca di Cardiologia a C. Erbel nonché una borsa di studio di ricerca dal tedesco accademico Servizio Heidelberg a L. Zhao.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
RPMI medium | Gibco | 21875-091 | n/a |
FCS | Gibco | 10270-106 | n/a |
Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | n/a |
15 ml tube | Sarstedt | 62,554,502 | n/a |
culture dish (60mm) | Orange Scientific | 5550200 | n/a |
LPS | Sigma | L4516 | n/a |
Cell Culture Plates 48-well | Greiner | 677102 | n/a |
Scalpel – single use | Feather | FEA200130011 | n/a |
TissueLyser | Precellys 24 Dual | Cat. No. EQ03119.200.RD010.0 | n/a |
RNeasy (Mini) Kit | Qiagen | Cat. No. 74104 | n/a |
Boehringer cDNA kit | Roche Diagnostics | Cat. No. 11483188001 | n/a |
Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | n/a |