Summary
La aterosclerosis es un proceso inflamatorio crónico. Este manuscrito ilustra un fácil utilizar el modelo ex vivo para investigar la carótida fresca o placas de la arteria coronaria. El modelo in vivo ex permite la investigación de sustancias potenciales sobre el medio inflamatorio en las lesiones ateroscleróticas humanas y los resultados pueden ser analizados mediante diversos métodos.
Abstract
La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria crónica de la vasculatura. Hay varios métodos para estudiar el compuesto inflamatoria en las lesiones ateroscleróticas. Los modelos de ratón son una herramienta importante para investigar los procesos inflamatorios en la aterogénesis, pero estos modelos adolecen de las diferencias fenotípicas y funcionales entre el murino y el sistema inmunológico humano. Experimentos in vitro de células se utilizan para evaluar específicamente los cambios de tipo dependiente de células causados por una sustancia de interés, pero las variaciones dependientes de la cultura y la incapacidad para analizar la influencia de moléculas específicas en el contexto del compuesto inflamatoria en las lesiones ateroscleróticas limitar el impacto de los resultados. Además, la medición de los niveles de una molécula de interés en la sangre humana ayuda a investigar más a fondo su relevancia clínica, pero esto representa la inflamación sistémica y no local. Por lo tanto, aquí se describe un modelo de cultivo de la placa para estudiar la biología de la lesión aterosclerótica humanaex vivo. En resumen, las placas frescas se obtuvieron de los pacientes sometidos a endarterectomía o cirugía de revascularización coronaria y se almacenan en un medio RPMI en hielo hasta su uso. Las muestras se cortan en pequeñas piezas seguido de distribución aleatoria en una placa de 48 pocillos, que contiene medio RPMI además de una sustancia de interés, tales como citocinas o quimiocinas solos o en combinación durante determinados períodos de tiempo. Después de la incubación, los pedazos de placa pueden ser de choque congelados para el aislamiento de ARNm, embebidos en parafina o PTU para la tinción inmunohistoquímica o destrozados y zadas por el Western Blot. Además, las células se pueden aislar de la placa para el análisis de citometría de flujo. Además, los sobrenadantes pueden ser recogidos para la medición de proteína por ELISA. En conclusión, el modelo in vivo ex presentado se abre la posibilidad de estudiar más a fondo la biología lesional inflamatoria, que puede dar lugar a la identificación de mecanismos de la enfermedad novela y dianas terapéuticas.
Introduction
La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria crónica es una de las principales causas de muerte en los países industrializados 1-2. Las complicaciones de la ateroesclerosis, síndromes coronarios agudos, especialmente, se han relacionado con la ruptura de las lesiones vulnerables, causando la aterotrombosis y la oclusión del vaso 3. La inmunidad innata y adaptativa parece estar involucrado en todas las etapas de la aterogénesis 2,4-5. Aunque se han logrado avances significativos en el tratamiento del infarto de miocardio, la prevención efectiva de la aterosclerosis y los eventos cardiovasculares adversos están aún sin resolver. Por lo tanto, el estudio de la biología lesional es esencial para aumentar nuestro conocimiento de la fisiopatología de la aterosclerosis y de permitir la identificación de nuevas dianas terapéuticas y el desarrollo de nuevas terapias.
En muchos casos, se utilizan modelos murinos para investigar la fisiopatología de las enfermedades específicas. Sin embargo, el estudio de la aterogénesis utilizando modelos de ratón es accompanied por varias limitaciones: (1) Por lo general, los ratones ateroscleróticos reciben una dieta alta en colesterol. Los niveles de colesterol en estos modelos no se pueden comparar con los de los pacientes con niveles séricos elevados de colesterol 6. (2) Existen diferencias sustanciales entre el murino y el sistema inmunológico humano; por lo tanto Foxp3 es un marcador específico de células T reguladoras murinos, mientras que la expresión de Foxp3 humano en células T humanas no necesariamente confiere un fenotipo regulador 7. También, el paradigma Th1/Th2 tal como se define en los seres humanos no es totalmente transferible a las células T murinas. (3) alternativa (M2) patrones de activación no existe un número de marcadores que se utilizan para identificar los monocitos y macrófagos murinos tales como F4/80 y los marcadores de la clásica (M1) vs en células mieloides humanos 8. (4) La expresión de genes de monocitos de sangre periférica murinos y humanos se ha encontrado para ser sustancialmente diferente 9.
Por lo tanto, con el fin de aumentar nuestra comprensión deprocesos inflamatorios crónicos en la aterosclerosis humana, tenemos que hacer uso de modelos de trabajo con los tejidos humanos, sangre o células. Aquí se describe un modelo de cultivo de tejidos placa humano, lo que permite la investigación de posibles nuevas sustancias en el concepto de la biología lesional inflamatoria humana.
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Protocol
1. Preparar medio de la siguiente
- Medio de cultivo: medio RPMI.
- Añadir suero de ternera fetal al 10% (FCS).
- Añadir 100 U / ml de penicilina G, y 100 g / ml de estreptomicina.
2. Almacenamiento de cilindro de la placa fresco hasta su uso
- La operación de la endarterectomía carotídea de pacientes con o sin síntomas de isquemia (infarto cerebral, ataque isquémico transitorio) con una estenosis significativa de la arteria carótida se llevará a cabo por los cirujanos vasculares y la endarterectomía de la arteria coronaria durante la cirugía de revascularización coronaria por cirujanos cardíacos. Placas carotídeas / coronarias necesitan ser removidos en bloque para preservar la estructura de la placa tal como se describe anteriormente 5.
- Después de la extirpación de la placa lugar la muestra en un tubo de medio lleno y lo almacenan en hielo (la placa tiene que estar completamente cubierta con medio) hasta su uso.
3. Procesamiento placa
- Utilice una placa de cultivo celular adecuado (por ejemplo, 60 mm)y añadir 5 ml de medio RPMI.
- Coloque el tejido de la placa en la placa de cultivo (placa debe estar completamente cubierta con el medio).
- Mantenga el tejido cuidadosamente la placa en los bordes del tejido mediante el uso de pinzas estériles.
- Cortar los bordes de la muestra de placa mediante el uso de un bisturí estéril.
- Dividir el tejido placa en medio.
- Evaluar la morfología de la lesión macroscópicamente (calcificada, rico en lípidos, roto, trombo, fibrosis).
- Analizar la morfología exacta de la placa después del experimento ex vivo mediante técnicas de inmunohistoquímica. Utilice la clasificación de la AHA 10.
- Deseche las placas con calcificación o fibrosis severa.
- Cortar el tejido en trozos pequeños de placa homólogas (3 x 3 x 3 mm).
- Choque congelar dos piezas de la placa y almacenarlos en nitrógeno líquido para los valores básicos de la lesión hasta su uso.
- Preparar una placa de 48 pocillos.
- Añadir 500 l de medio RPMI a cada pocillo utilizado para el experimento.
- Por favor, use unt menos dos piezas de la placa para cada grupo.
- Añadir la sustancia de interés (por ejemplo, citocinas y quimiocinas específicas).
- Utilice pedazos de placa no estimulados como controles.
- Aleatoriamente plantar el número apropiado de piezas de placa en los pocillos.
- Cultura de las piezas de la placa para los puntos de tiempo indicados.
- Para la placa de tejido Experimento de estimulación con lipopolisacárido (LPS)
- Utilice los siguientes puntos de tiempo: 3 horas, 8 horas y 24 horas.
- Utilice 2 piezas de placa de los LPS y dos para el grupo no estimulado para cada punto de tiempo, respectivamente.
- Añadir 1 g / ml de lipopolisacárido.
- Durante la incubación, mantener la placa de 48 pocillos a 37 ° C en aire humidificado que contiene 5% de CO 2.
4. Tiempo de cosecha trozos de tejido de la placa Después indicados
- Choque congelar las piezas de la placa para el aislamiento del ARNm y la síntesis de ADNc (para información detallada, ver protosección col 5).
- Recoger el sobrenadante y se almacena a -20 ° C para el análisis de ELISA.
- Para el Western Blot, smash y lisar el tejido de la placa. Filtrar el lisado a través de un 0,65 micras y 0,1 micras dispositivo de filtro centrífugo.
- Incrustar el tejido de la placa en el tejido-tec o parafina para tinciones de inmunohistoquímica.
5. La extracción de ARN a partir de piezas de placa cultivadas
- Utilice un TissueLyser para la homogeneización.
- Aislar el ARN utilizando el kit de (ver tabla materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Determinar la cantidad de ARN y la calidad de las muestras con espectrofotómetro.
- Utilice el kit de ADNc de Boehringer para la transcripción inversa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Para la PCR cuantitativa, utilizar por ejemplo el kit de PCR en tiempo real de Roche con SYBR Green.
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Representative Results
Aquí presentamos una serie de cifras que demuestran resultados del cultivo vivo ex placa. Para evaluar los cambios en el medio inflamatorio en respuesta al agente de interés en el modelo ex vivo de experimento, medimos diferentes moléculas que se sabe que son principalmente implicados en la aterogénesis. Como las citoquinas pro-aterogénicas representativas elegimos TNFa, IL-6 y IFNg 2,11. Además, se utiliza el factor de von Willebrand y el factor tisular para evaluar los cambios pro-trombóticos. Además, para abordar el desarrollo de inestabilidad de la placa inducida por un agente de interés, la matriz metalopeptidasa 9 (MMP9) se analizaron los niveles. Chemoattractance es también un paso importante en la progresión de la placa y la regresión 11, por lo tanto, investigamos los niveles de CCL2, también conocidos como proteína quimiotáctica de monocitos-1 (MCP-1), principio quimioatrayente para los monocitos / macrófagos. Después de laminación celular atracción celular y la adhesión son los siguientes pasos.Por eso elegimos ICAM-1. Mediante el análisis de las vías de señalización más influenciados por la sustancia de interés que utilizamos quinasas extracelulares reguladas por señales-(ERK1 / 2), ampliamente expresado y activado por muchos estímulos diferentes, tales como citoquinas, la apoptosis, la diferenciación, la infección por virus y ligandos para la proteína G heterotrimérica receptores acoplados a 12.
En primer lugar, se muestra el tiempo los cambios dependientes del compuesto inflamatorio de las lesiones ateroscleróticas en cultivo estimuladas, analizados por reacción cuantitativa en tiempo real de la polimerasa en cadena (QRT-PCR) (Figura 1). Durante el cultivo de la placa, un aumento de la actividad del medio lesional inflamatoria se puede observar. No se encontraron diferencias después de 3 horas versus ninguna cultura (datos no presentados). Después de 8 horas de cultivo en placa, se encontró sólo una ligera regulación positiva de algunas moléculas, tales como IL-6, pero no de un TNF e IFN g, mientras que después de 24 horas, no había una regulaciónde diversas moléculas tales como TNF a, IL-6 e IFN g. En particular, el más largo es el tiempo de cultivo de placa más alta es la variación de la expresión de moléculas son.
En segundo lugar, para demostrar la viabilidad de influir en el medio inflamatorio en las lesiones ateroscleróticas, presentamos los resultados de pedazos de placa se incubaron con 1 mg / ml de LPS durante 3 horas, medido por QRT-PCR (Figura 2). Pedazos de placa no estimuladas sirvieron como control negativo . Hemos encontrado que el LPS indujo un marcado aumento de la calificación de la activación del compuesto inflamatoria dentro de las lesiones ateroscleróticas. Varias citoquinas (IL6, TNF un etc, Figura 2A-B), quimiocinas (CCL2, etc, que no se muestran), la adhesión (ICAM1, que no se muestra), de desestabilización de la placa (Matriz metalopeptidasa 9 (MMP9), que no se muestra) y pro- moléculas trombóticos (factor de von Willebrand, la Figura 2C, En tercer lugar, para evaluar la abundancia de proteínas, sobrenadantes de cultivos de las lesiones fueron analizados por ELISA y rompieron los tejidos de la placa por el Western Blot (Figura 3D). En la Figura 3A-C, se muestra el análisis de ELISA de IFN-g, MCP-1 y TNF-a en el sobrenadante de muestras cultivadas incubadas con LPS o de control durante 8 h. Además, el análisis de transferencia Western para (fosforilada) de ERK 1/2 de los tejidos de placa rotas y lisadas, o bien se estimularon con LPS o de control, se demuestra en la Figura 3D. 
Figura 1. Efecto del cultivo de placa en el compuesto lesional inflamatoria en el tiempo. Piezas de la placa aterosclerótica se escandalizan inmediatamente congelados o cultivados durante 8o 24 horas y la expresión de citoquinas indicadas IL6 (A), IFN g (B) y TNF (c) se analizaron mediante qRT-PCR. Los resultados mostrados representan la media de cinco experimentos independientes. Cinco piezas lesión aterosclerótica para cada grupo se utilizaron para el punto de tiempo indicado. Los valores se normalizan a la b-actina y se expresaron como copias de cDNA / 1000 copias b-actina. Los resultados se muestran como diagramas de caja que muestran la media y la 25 ª y 75 º percentiles como cajas y 10 º y 90 º percentiles como bigotes. *: P <0,01. 
Figura 2. La estimulación LPS de las piezas de placa cultivadas inducida por un aumento de diversas moléculas inflamatorias. Piezas de placa se incubaron con / ml de LPS 1 microgramoso no estimulada durante 3 horas y se analizaron mediante QRT-PCR. Los resultados mostrados representan la media de cinco experimentos independientes. Se utilizaron dos piezas para cada grupo. Los valores se normalizan a la b-actina y se expresaron como copias de cDNA / 1000 copias b-actina. Los resultados se muestran como diagramas de caja que muestran la media y la 25 ª y 75 º percentiles como cajas y 10 º y 90 º percentiles como bigotes. *: P <0,01. 
Figura 3. Expresión de la proteína en el sobrenadante de la placa de cultivo. Mediciones representativas de ELISA de citoquinas IFN-g (A), TNF-a (B) y MCP-1 (C) en el sobrenadante de las piezas de placa tratadas con LPS o no estimulado para 8 se muestran h. Los resultados mostrados representan la media de cinco experimentación independientests. Los resultados se muestran como diagramas de caja que muestran la media y la 25 ª y 75 º percentiles como cajas y 10 º y 90 º percentiles como bigotes. Además, el Western Blot representativo para (fosforilada) de ERK 1/2 de estimuladas con LPS o el control de las lesiones ateroscleróticas en cultivo después de 3 h se demuestra en la Figura 3D. Los gráficos de barras que muestran la columna media + SEM como bigotes representan el promedio de cinco experimentos independientes. *: P <0,01.
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Discussion
Aquí presentamos un modelo in vivo de cultivo ex placa para investigar la influencia de sustancias potencialmente relevantes en la biología de la lesión aterosclerótica. La principal ventaja de este método ex vivo es la capacidad de evaluar la influencia de las sustancias indicadas en las células inflamatorias y su interacción celular, así como las vías inflamatorias y cascadas dentro de lesiones ateroscleróticas humanas. Varios métodos utilizables (por ejemplo, RT-PCR, western blot, inmunohistoquímica, citometría de flujo, ELISA) ayudan a proporcionar un análisis completo de los efectos de la sustancia de interés en la inflamación de la lesión aterosclerótica.
Los procesos inflamatorios en la aterosclerosis murino se conocen bien, también gracias a los modelos de ratones que sobre-expresan o que carecen de ciertos genes de interés 11. Sin embargo, los resultados no siempre se corresponden estrechamente con los seres humanos 6-9,13. Ratones ateroscleróticas suelen recibir un alto chol patológicaESTEROL dieta 6. Además, se sabe que los sistemas inmunes entre seres humanos y ratones muestran diferencias sustanciales 7-9. A continuación, presentamos un modelo in vivo ex cultura placa, lo que permite el estudio de la influencia de una sustancia de interés en el compuesto inflamatoria en las lesiones ateroscleróticas humanas como lo demuestra Niessner et al. 14. Por otra parte, varios métodos adicionales se pueden utilizar para analizar los resultados de un experimento de cultivo de la placa, comparables a los estudios murinos. Por lo tanto, el modelo in vivo ex abre la posibilidad de sustituir murino en estudios in vivo en algunos casos y puede representar un método excelente de puente entre un aterosclerosis putativo promover la molécula en el sistema murino y la traducción a la biología humana.
El modelo humano ex vivo para la aterosclerosis no es comparable con los experimentos in vitro de células. Las líneas celulares se pueden almacenar con facilidad y culta, pero son fenotípicamente y functionally no idénticas a las células primarias. Células frescas se pueden obtener mediante la sangre regularmente atrae, pero es a veces muy difícil de cultivar ellos y la cultura se somete a muchos factores. Además, mediante el uso en experimentos de cultivo celular in vitro, no es posible investigar la influencia de moléculas específicas en el compuesto inflamatoria en las lesiones ateroscleróticas. Por lo tanto, los experimentos in vitro son importantes para la (traslación) paso inicial para las investigaciones de biología humana, pero no para analizar más a fondo el papel de la molécula de interés en el concepto de la aterosclerosis humana, especialmente interacción celular y la influencia en las cascadas inflamatorias y vía dentro de las lesiones ateroscleróticas .
Monaco et al. Estableció un importante sistema de cultivo a corto plazo de las células aisladas de tejido aterosclerótica humana 15. Han utilizado una mezcla enzimática de la colagenasa, elastasa y DNasa. Este método permite la investigación de Lesiexperimentos célula-célula onal, señalización vía de análisis y estudios de transferencia génica con vectores adenovirales. Pero aún se desconoce cómo la mezcla enzimática influye en las células, es decir, graduado de la activación, la expresión de marcadores de superficie, etc Además, cabe preguntarse si los resultados de estos experimentos reflejan los procesos reales dentro de las lesiones ateroscleróticas. Por otra parte, la ubicación original de las células será destruida por la mezcla enzimática y el sistema de cultivo a corto plazo tiene las mismas limitaciones que los experimentos in vitro de células en.
Para los estudios de célula o población de células específicas dentro de una lesión aterosclerótica, es posible utilizar el método de disección micro captura por láser. El compuesto célula o célula de interés será cortado fuera del tejido mediante el uso de un puerto de infrarrojos o UV-láser y ARN, ADN o el análisis de proteínas se puede realizar. La disección de captura micro láser no parece dañar las células, la Expre receptor de superficie celularssion etc La ventaja del método es el análisis de una célula o un lugar de interés dentro de una lesión aterosclerótica. Pero no es posible una evaluación adicional de las células tales como los estudios in vitro.
El modelo in vivo ex implica una amplia gama de posibles métodos para medir y analizar los resultados. Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real se puede realizar después de aislamiento de ARN y la síntesis de ADNc para investigar el nivel de expresión génica como se muestra por Niessner et al. 14. La inmunohistoquímica es una herramienta establecida para evaluar el nivel de proteína con el fin de demostrar la expresión de la proteína y el origen celular en el interior de las lesiones ateroscleróticas. Western Blot se puede utilizar para analizar las vías de señal. Además, el aislamiento de células mediante digestión en una solución de enzima se abre la oportunidad de realizar el análisis de citometría de flujo para analizar aún más para el tipo de célula de ejemplo, los subtipos celulares y el grado de activación. Además, después del aislamiento de célulasspectratyping representan un buen método para analizar más a fondo la variabilidad del receptor de células T. Por otra parte, tras el aislamiento de células magnético digestión es un método de alta calidad probada de separación de células de los subtipos celulares específicos para estudios adicionales in vitro o análisis de microarrays. Por fin, los sobrenadantes se pueden recoger para la medición de proteínas por ELISA. En conclusión, el modelo in vivo ex es una herramienta valiosa para investigar los cambios exactos en el medio inflamatorio en las lesiones ateroscleróticas humanas.
El modelo in vivo ex se basa en muestras de endarterectomía. El uso de placas ateroscleróticas obtenidos a partir de diferentes individuos puede resultar en un mayor grado de composición celular diferencial y por lo tanto mayor variación de los niveles de los genes / proteínas de interés. Por lo tanto, es importante utilizar muestras de placa ricos o complicados de lípidos en lugar de lesiones fibroesclerótico 10, debido a que la respuesta inflamatoria es notablemente inferior en Lesio fibroescleróticons. Por lo tanto, es de gran interés para evaluar la morfología de la placa antes de analizar los resultados de los experimentos de cultivo de placa.
Además, cada muestra de espécimen incluye diferentes etapas de la lesión aterosclerótica desarrollo / progresión, de la disfunción endotelial inicial y paso la acumulación de lípidos, hacia estrías de grasa y el desarrollo de un núcleo necrótico a placas rotas. Por lo tanto, con el fin de minimizar la heterogeneidad del tejido de la placa, es necesario cortar los bordes, que generalmente representan los primeros pasos de la aterogénesis.
No se puede excluir que el corte induce respuestas de lesiones de tejidos. Pero nuestros experimentos de cultivo de tejidos de placa mostraron niveles de expresión génica comparables de los tejidos de la placa de cultivo de tejidos de placa no cultivadas. Por lo tanto, esto subraya que el método actual es una buena herramienta para investigar el medio inflamatoria en las lesiones ateroscleróticas.
La cultura de lapedazos de placa se limita a un período de tiempo de hasta un día. Si el tejido de la placa se cultivó más de un día, la variación de los resultados se incrementa dramáticamente. Además, después de 3 días la composición de la placa y la morfología se derrumba.
Hay limitaciones que deben tenerse en cuenta al aplicar este modelo. El modelo in vivo ex es un buen método para estudiar el medio inflamatoria en las lesiones ateroscleróticas. Sin embargo, los componentes principales faltan en este contexto. No hay características hemodinámicas son aplicables y las influencias sistémicas son totalmente desaparecida. Además, con este método sólo es posible para investigar los cambios a corto plazo, pero carece de un análisis a largo plazo debido a la caída de la morfología de la placa.
En conclusión, se presenta aquí un método que sea útil para los investigadores que están interesados en la investigación de nuevas moléculas potenciales sobre la inflamación de la lesión aterosclerótica humana. El ex vivo placa cmodelo ulture hace sufrir de las diferencias entre el murino y el sistema inmunológico humano, pero nos da la capacidad de analizar la interacción celular en el contexto de las lesiones ateroscleróticas y representan la oportunidad de investigar las cascadas inflamatorias lesional locales y caminos. El método de cultivo ex vivo de placa descrito aquí es fácil de usar y es reproducible y puede ayudar a identificar y validar nuevos mecanismos de la enfermedad y dianas terapéuticas.
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Disclosures
Los autores no tienen ningún conflicto a revelar.
Acknowledgments
Damos las gracias a Nadine Wambsganss por su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG) 682/2-1 ER y un estipendio de investigación de la Sociedad Alemana de Cardiología a C. Erbel, así como un estipendio investigación del alemán Servicio Académico Heidelberg a L. Zhao.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium | Gibco | 21875-091 | |
| FCS | Gibco | 10270-106 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | |
| 15 ml Tube | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Culture dish (60 mm) | Orange Scientific | 5550200 | |
| LPS | Sigma | L4516 | |
| Cell culture plates 48-well | Greiner | 677102 | |
| Scalpel - single use | Feather | FEA200130011 | |
| TissueLyser | Precellys 24 Dual | Cat. No. EQ03119.200.RD010.0 | |
| RNeasy (Mini) Kit | Qiagen | Cat. No. 74104 | |
| Boehringer cDNA kit | Roche Diagnostics | Cat. No. 11483188001 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific |
References
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