Summary
Atherosklerose ist ein chronischer Entzündungsprozess. Diese Handschrift veranschaulicht eine einfach zu ex-vivo-Modell verwenden, um frische carotis oder koronare Herz Plaques zu untersuchen. Die ex vivo-Modell erlaubt die Untersuchung möglicher Substanzen auf die entzündlichen Milieu in menschlichen arteriosklerotischen Läsionen und die Ergebnisse können mit verschiedenen Verfahren untersucht werden.
Abstract
Atherosklerose ist eine chronische entzündliche Erkrankung der Blutgefäße. Es gibt verschiedene Methoden, um die Entzündungs Verbindung in atherosklerotischen Läsionen zu studieren. Mausmodelle sind ein wichtiges Instrument, um entzündliche Prozesse in der Atherogenese zu untersuchen, aber diese Modelle leiden unter der phänotypischen und funktionellen Unterschiede zwischen der murinen und humanen Immunsystems. In-vitro-Zellexperimenten verwendet werden, um gezielt auswerten Zelltyp-abhängigen Veränderungen durch eine Substanz verursacht Interesse, aber kulturabhängigen Schwankungen und die Unfähigkeit, den Einfluss von spezifischen Molekülen im Rahmen der Entzündungs Verbindung in atherosklerotischen Läsionen zu analysieren begrenzen die Auswirkungen der Ergebnisse. Zusätzlich Messen der Werte eines Moleküls von Interesse in menschlichen Blut hilft weiter zu untersuchen ihrer klinischen Relevanz, aber dies stellt keine systemische und lokale Entzündungen. Deshalb beschreiben wir eine Gedenktafel Kulturmodell der menschlichen atherosklerotischen Läsion Biologie studierenex vivo. Kurz, frisch Plaques aus Patienten, die Endarteriektomie oder koronaren Bypass-Operation erhalten und in RPMI-Medium auf Eis bis zur Verwendung gelagert. Die Proben werden in kleine Stücke, gefolgt von statistischer Verteilung in eine 48-Well-Platte geschnitten, enthaltend RPMI-Medium zusätzlich eine Substanz von Interesse, wie Cytokine oder Chemokine, allein oder in Kombination für definierte Zeiträume. Nach der Inkubation können die Plaquestücke Schock für die mRNA-Isolierung eingefroren werden, in Paraffin oder Oktober für die Immunhistochemie Färbung eingebettet oder zerschlagen und Western-Blot-lysiert. Ferner können Zellen, die aus der Tafel für die Durchflußzytometrie-Analyse isoliert werden. Darüber hinaus können die Überstände für die Protein Messung durch ELISA gesammelt werden. Abschließend öffnet sich das vorgestellt ex vivo-Modell die Möglichkeit, entzündliche läsionaler Biologie, die bei der Identifizierung von Krankheitsmechanismen und neue therapeutische Ziele führen kann weiter studieren.
Introduction
Atherosklerose als eine chronische entzündliche Krankheit ist eine der Haupttodesursachen in den Industrienationen 02.01. Komplikationen der Arteriosklerose, insbesondere akutem Koronarsyndrom, haben zum Bruch der gefährdeten Läsionen in Verbindung gebracht worden, was zu Atherothrombose und Gefäßverschluss 3. Angeborenen und erworbenen Immunität scheint bei allen Schritten von 2,4-5 Atherogenese beteiligt sein. Obwohl bedeutende Fortschritte in der Behandlung von Herzinfarkt, eine wirksame Prävention von Arteriosklerose und kardiovaskulären Nebenwirkungen gemacht worden sind noch ungelöst. So studieren läsionaler Biologie ist wichtig für die Erhöhung unserer Kenntnisse über die Pathophysiologie der Atherosklerose und die Identifikation neuer therapeutischer Targets und Entwicklung neuartiger Therapien zu ermöglichen.
In vielen Fällen werden murine Modelle verwendet, um die Pathophysiologie von spezifischen Krankheiten zu untersuchen. , Studium der Atherogenese mit Maus-Modellen ist jedoch accodurch mehrere Einschränkungen mpanied: (1) In der Regel erhalten atherosklerotischen Mäusen einen hohen Cholesterin-Diät. Der Cholesterinspiegel in diesen Modellen nicht mit denen bei Patienten mit erhöhten Cholesterin-Serumspiegel 6 verglichen werden. (2) Es gibt erhebliche Unterschiede zwischen den murinen und humanen Immunsystem; somit Foxp3 ist ein spezifischer Marker für Maus-regulatorischen T-Zellen, wohingegen menschliche Foxp3-Expression in humanen T-Zellen nicht unbedingt eine regulatorische Phänotyp verleihen 7. Auch die Th1/Th2 Paradigma wie beim Menschen ist nicht definiert, um Maus-T-Zellen vollständig übertragbar. (3) Eine Reihe von Markern, die verwendet werden, um murine Monozyten und Makrophagen, wie F4/80 und Markierungen der klassischen (M1) zu identifizieren vs Alternative (M2) Aktivierungsmuster nicht in der menschlichen myeloischen Zellen 8 vorhanden. (4) Gene Expression des murinen und humanen Monozyten im peripheren Blut wurde gefunden, wesentlich 9 sein.
So, um unser Verständnis von erhöhenchronische Entzündungsprozesse im menschlichen Atherosklerose, müssen wir den Einsatz von Modellen der Arbeit mit menschlichen Gewebe, Blut oder Zellen zu machen. Hier beschreiben wir ein Modell der menschlichen Plaquegewebe Kultur, die Untersuchung möglicher neuer Substanzen in das Konzept der menschlichen Entzündungs läsionaler Biologie ermöglicht.
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Protocol
1. Bereiten Medium wie folgt
- Kulturmedium: RPMI-Medium.
- Werden 10% fötalem Kälberserum (FCS).
- Mit 100 U / ml Penicillin G und 100 g / ml Streptomycin.
2. Lagerung von frischen Plaque Zylinder bis zur Verwendung
- Die Karotis-Endarteriektomie Betrieb von Patienten mit oder ohne ischämische Symptome (Schlaganfall, transitorische ischämische Attacke) mit einer signifikanten Karotisstenose werden von Gefäßchirurgen und koronare Herz Endarteriektomie bei koronaren Bypass-Operationen von Herzchirurgen durchgeführt werden. Karotis / koronare Plaques müssen en bloc entfernt werden, um die Plaque Struktur zu erhalten wie zuvor 5 beschrieben.
- Nach Plaque Ausrottung Ort die Probe in einem Medium gefüllten Schlauch und speichern Sie es auf Eis (Plaque muss komplett mit Medium bedeckt sein) bis zur Verwendung.
3. Plaque Verarbeitung
- Verwenden Sie eine ausreichende Zellkulturschale (zB 60 mm)und mit 5 ml RPMI-Medium.
- Legen Sie das Plaquegewebe in der Kulturschale (Plaque sollte komplett mit Medium bedeckt sein).
- Halten Sie die Plaquegewebe sorgfältig an den Kanten des Gewebes unter Verwendung einer sterilen Pinzette.
- Abschneiden der Ränder des Plättchens Probe mit einem sterilen Skalpell.
- Teilen Sie Plaquegewebe in der Hälfte.
- Bewerten Sie die Läsion makroskopisch Morphologie (verkalkt, lipidreichen, gebrochen, Thrombus, Fibrose).
- Analysieren Sie die genaue Plaquemorphologie nach dem Ex-vivo-Experiment durch Immunhistochemie. Verwenden Sie den AHA Klassifizierung 10.
- Entsorgen Plaques mit schwerer Verkalkung oder Fibrose.
- Schneiden Sie das Plaquegewebe in homologe kleine Stücke (3 x 3 x 3 mm).
- Schock einfrieren zwei Stücke Plaque und speichern sie in flüssigem Stickstoff für die Grundwerte der Läsion bis zur Verwendung.
- Bereiten Sie eine 48-Well-Platte.
- Gib 500 ul RPMI-Medium zu jeder Vertiefung für den Versuch verwendet.
- Bitte verwenden Sie eint mindestens zwei Plaquestücke für jede Gruppe.
- In die Substanz von Interesse (zB bestimmte Zytokine und Chemokine).
- Verwenden Sie nicht stimulierten Plaque Stücke als Kontrollen.
- Die Anzahl der Plaque eignet Stücke zufällig pflanzen in die Vertiefungen.
- Kultur die Plaque-Stücke für angegebenen Zeitpunkten.
- Für die Plaquegewebe Stimulationsversuch mit Lipopolysaccharid (LPS)
- Verwenden Sie die folgenden Zeitpunkten: 3 Stunden, 8 Stunden und 24 Stunden.
- Anwendung 2. Plaquestücke für die LPS und zwei für die nicht-stimulierten Gruppe für jeden Zeitpunkt sind.
- 1 ug / ml Lipopolysaccharid.
- Während der Inkubation Aufrechterhaltung der 48-Well-Platte bei 37 ° C in befeuchteter Luft mit 5% CO 2.
4. Nach angegebene Zeit der Ernte Plaque Gewebestücke
- Schock Einfrieren der Plaque Stücke für die mRNA-Isolierung und cDNA-Synthese (detaillierte Informationen siehe Proto-col Abschnitt 5).
- Die überstehende Flüssigkeit und gelagert bei -20 ° C für die ELISA-Analyse.
- Für Western-Blot, smash und Lyse Plaquegewebe. Filtern Sie die Lysat durch einen 0,65 um und 0,1 um Kreiselfiltereinrichtung.
- Embed Plaquegewebe im Gewebe-tec oder Paraffin für die Immunhistochemie Färbungen.
5. RNA-Extraktion aus kultivierten Plaquestücke
- Verwenden Sie einen TissueLyser zur Homogenisierung.
- Isolieren Sie die RNA durch Verwendung des Kits (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Bestimmen Sie die RNA-Menge und Qualität der Proben mit Spektralphotometer.
- Verwenden der Boehringer cDNA Kit zur reversen Transkription nach Herstellerangaben.
- Für die quantitative PCR, verwenden Sie zum Beispiel die Roche Echtzeit-PCR-Kit mit SYBR Green.
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Representative Results
Hier präsentieren wir eine Reihe von Figuren, die Ergebnisse der Ex-vivo-Plaque Kultivierung demonstrieren. Änderungen in der entzündlichen Umgebung in Reaktion auf das Mittel von Interesse in der ex-vivo-Modellexperiment beurteilen, messen wir verschiedene Moleküle, die bekannt sind in erster Linie in der Atherogenese beteiligt werden. Als Vertreter pro-atherogenen Zytokine wir wählen TNFa, IL-6 und IFNg 2,11. Darüber hinaus verwenden wir von-Willebrand-Faktor und Gewebefaktor pro-thrombotischen Veränderungen beurteilen. Darüber hinaus, um die Entwicklung von Plaque Instabilität von einem Agenten von Interesse induziert, Matrix Metallopeptidase 9 (MMP9) Ebenen analysiert werden sollten. Chemoattractance ist ebenfalls ein wichtiger Schritt in der Plaque Progression und Regression 11. Somit untersuchen wir das Niveau von CCL2, auch Monozyten-chemotaktisches Protein-1 (MCP-1), chemoattraktive Prinzip für Monozyten / Makrophagen bezeichnet. Nach der Zell Attraktion Zellroll und Haftung sind die folgenden Schritte.Aus diesem Grund wählen wir ICAM-1. Durch weitere Analyse der Signalwege durch die Substanz von Interesse beeinflusst verwenden wir extrazelluläre Signal-regulierten Kinasen (ERK1 / 2), weit verbreitet exprimiert und durch verschiedene Stimuli, wie Zytokine, Apoptose, Differenzierung, Virusinfektion und Liganden für heterotrimeren G-Protein aktiviert, 12-gekoppelten Rezeptoren.
Zuerst zeigen wir zeitabhängige Veränderungen der Entzündungs Verbindung der unstimulierten kultivierten atherosklerotischen Läsionen, durch quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) (Abbildung 1) analysiert. Während Plaque Kultivierung kann eine Erhöhung der Aktivität des inflammatorischen läsionaler Milieu beobachtet werden. Kein Unterschied wurde nach 3 h vs ohne Kultur (Daten nicht gezeigt) gefunden. Nach 8 h Plaquekultur, fanden wir nur eine geringe Hochregulation von einigen Molekülen, wie IL-6, aber nicht der TNF-a und IFN-g, während nach 24 Stunden gab es eine Hochregulierungverschiedener Moleküle wie TNF a, IL-6 und IFN-g. Bemerkenswert ist, desto länger die Zeit der Plaquekultur je höher die Variation der Molekülexpression sind.
Zweitens, um die Machbarkeit der Beeinflussung der entzündlichen Milieu, in atherosklerotischen Läsionen zu demonstrieren, präsentieren wir Ergebnisse der Plaquestücke mit 1 ug / ml LPS für 3 Stunden, durch qRT-PCR gemessen (Abbildung 2) inkubiert. Unstimulierte Plaque Stücke dienten als negative Kontrolle . Wir fanden, dass LPS induzierte eine deutliche Zunahme der Grad der Aktivierung der Entzündungs Verbindung innerhalb atherosklerotischen Läsionen. Verschiedene Zytokine (IL-6, TNF-a usw., Fig. 2A-B), Chemokine (CCL2 usw., nicht gezeigt), Haftung (ICAM-1, nicht dargestellt), Plaque destabilisierende (Matrix metallopeptidase 9 (MMP9), nicht gezeigt) und pro- thrombotischen Moleküle (von Willebrand-Faktor, 2C, Drittens, die Proteinmenge auszuwerten, Ständen von kultivierten Läsionen wurden durch ELISA analysiert und zertrümmerte Plaquegewebe durch Western Blot (Abbildung 3D). In Fig. 3A-C zeigen wir ELISA-Analyse von IFN-g, MCP-1 und TNF-a in dem Überstand der kultivierten Proben mit LPS oder Kontrolle für 8 h inkubiert. Zusätzlich zur Western Blot-Analyse (phosphoryliert) ERK 1/2 zertrümmert und Plaque-Gewebe lysiert, entweder mit LPS stimulierten Kontrolle und wird in Fig. 3D gezeigt. 
Abbildung 1. Effect Kultivierung von Plaque auf den Entzündungs läsionaler Verbindung über die Zeit. Atherosklerotischer Plaque Stücke wurden sofort schockgefroren oder Zucht für 8oder 24 h und Expression von Zytokinen angegeben IL6 (A), IFN-g (b) und TNF-a (C) wurde durch qRT-PCR analysiert. Die gezeigten Ergebnisse stellen den Durchschnitt von fünf unabhängigen Experimenten. Fünf atherosklerotische Läsion Stücke für jede Gruppe wurden für angegebenen Zeitpunkt verwendet. Werte sind auf b-Actin und als cDNA Kopien / 1000 b-Actin-Kopien. Die Ergebnisse sind als Box-Plots Anzeige Mittelwert und 25. und 75. Perzentile als Boxen und 10. und 90. Perzentile als Whisker gezeigt. *: P <0,01. 
2. LPS-Stimulation von kultivierten Plaquestücke induzierte einen Anstieg verschiedener Entzündungsmolekülen. Plaque-Stücke wurden mit 1 ug / ml LPS inkubiertoder 3 Stunden nicht stimulierten und qRT-PCR analysiert. Die gezeigten Ergebnisse stellen den Durchschnitt von fünf unabhängigen Experimenten. Zwei Stücke für jede Gruppe verwendet. Werte sind auf b-Actin und als cDNA Kopien / 1000 b-Actin-Kopien. Die Ergebnisse sind als Box-Plots Anzeige Mittelwert und 25. und 75. Perzentile als Boxen und 10. und 90. Perzentile als Whisker gezeigt. *: P <0,01. 
3. Proteinexpression in dem Überstand von kultivierten Plaque. Repräsentative ELISA-Messungen von Cytokinen IFN-g (A), TNF-a (B) und MCP-1 (C) in dem Überstand von Plaque-Stücke mit LPS-stimulierten oder 8 behandelt hr gezeigt. Die gezeigten Ergebnisse stellen den Mittelwert aus fünf unabhängigen Versuchsts. Die Ergebnisse sind als Box-Plots Anzeige Mittelwert und 25. und 75. Perzentile als Boxen und 10. und 90. Perzentile als Whisker gezeigt. Zusätzlich repräsentative Western Blot für (phosphoryliert) ERK 1/2 der LPS stimuliert oder Kontrolle kultiviert atherosklerotischen Läsionen nach 3 h ist in Fig. 3D gezeigt. Die Spalten Balken Anzeige Mittelwert + SEM als Whisker stellen den Durchschnitt von fünf unabhängigen Experimenten. *: P <0,01.
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Discussion
Hier präsentieren wir eine Ex-vivo-Plaque-Kultur-Modell, um den Einfluss der potenziell relevanten Substanzen auf atherosklerotische Läsion Biologie zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser ex vivo-Verfahren ist die Möglichkeit, den Einfluß der genannten Stoffe auf Entzündungszellen und ihre Wechselwirkung zellulärer sowie Entzündungswege und Kaskaden innerhalb der menschlichen atherosklerotischen Läsionen zu beurteilen. Mehrere nutzbare Methoden (zB RT-PCR, Western-Blot, Immunhistochemie, Durchflusszytometrie, ELISA) Hilfe, um eine umfassende Analyse der Auswirkungen der Substanz von Interesse auf atherosklerotische Läsion Entzündung zu schaffen.
Die entzündlichen Prozesse in murinen Atherosklerose sind gut verstanden, auch dank Maus-Modellen Überexpression oder fehlen bestimmte Gene von Interesse 11. Allerdings sind die Ergebnisse nicht immer eng an Menschen 6-9,13 entsprechen. Atherosklerotischen Mäusen erhalten in der Regel eine hohe pathologische cholEsterol Diät 6. Darüber hinaus ist bekannt, dass das Immunsystem zwischen Menschen und Mäusen zeigen erhebliche Unterschiede 9.7. Hier präsentieren wir eine Ex-vivo-Plaque-Kultur-Modell, das die Untersuchung des Einflusses einer Substanz von Interesse auf der hemmende Verbindung in der menschlichen atherosklerotischen Läsionen ermöglicht, wie durch Niessner et al. 14 gezeigt. Darüber hinaus können verschiedene zusätzliche Verfahren verwendet, um die Ergebnisse eines Plaquekultur Experiment vergleichbar murinen Studien analysieren. Daher öffnet sich die ex-vivo-Modell die Möglichkeit, Maus in vivo-Studien in einigen Fällen zu ersetzen, und kann ein ausgezeichnetes Verfahren zur Brückenbildung zwischen einem mutmaßlichen Atherosklerose fördern Molekül im murinen System und Übersetzung in der Humanbiologie darstellen.
Der menschliche Ex-vivo-Modell für Atherosklerose ist nicht vergleichbar mit in-vitro-Zellexperimenten. Zelllinien können leicht gelagert und kultiviert werden, sind aber phänotypisch und functionally nicht identisch mit Primärzellen. Frische Zellen können durch regelmäßige Blutentnahmen erhalten werden, aber es ist manchmal schwierig zu kultivieren und die Kultur wird von vielen Faktoren unterworfen. Zusätzlich kann durch Verwendung von in vitro Zellkulturexperimenten ist es nicht möglich, den Einfluss von spezifischen Molekülen auf der hemmende Verbindung in atherosklerotischen Läsionen zu untersuchen. So sind in-vitro-Experimente wichtig für die anfängliche (translationale) Schritt für Humanbiologie Untersuchungen, aber nicht, um weiter zu analysieren, die Rolle des Moleküls von Interesse in das Konzept der menschlichen Atherosklerose, vor allem Zellzusammenspiel und Einfluss auf Entzündungskaskaden und Weg in atherosklerotischen Läsionen .
Monaco et al. Etabliert eine wichtige kurzfristige Kultursystem von Zellen aus menschlichen atherosklerotischen Gewebe 15 isoliert. Sie haben eine enzymatische Mischung aus Collagenase, Elastase und DNase verwendet. Diese Methode ermöglicht Untersuchung der lesional Zell-Zell-Experimenten, Signalpfadanalyse und Gentransfer-Studien mit Adenovirus-Vektoren. Aber es bleibt unbekannt, wie die enzymatische Mischung beeinflusst die Zellen, also grad der Aktivierung, Oberflächenmarker Ausdruck etc. Darüber hinaus ist fraglich, ob die Ergebnisse dieser Experimente die realen Prozesse in atherosklerotischen Läsionen. Darüber hinaus wird die ursprüngliche Position der Zellen durch enzymatische Mischung zerstört werden und die Kurzzeitkultur-System hat die gleichen Einschränkungen wie für die in vitro Zellexperimenten.
Für spezifische Zelle oder Zellpopulation Studien innerhalb einer atherosklerotischen Läsion, ist es möglich, die Laser-Capture-Mikrodissektion Methode. Die Zelle oder Zell Verbindung von Interesse wird aus dem Gewebe durch Verwendung eines Infrarot-oder UV-Laser und RNA, DNA oder Protein-Analyse kann durchgeführt werden, geschnitten werden. Laser-Capture-Mikrodissektion scheint nicht die Zellen schädigen, die Zelloberflächenrezeptor expreSsion usw. Der Vorteil des Verfahrens ist die Analyse von einer Zelle oder einer Stelle von Interesse innerhalb einer atherosklerotischen Läsion. Aber es ist nicht möglich, die Zellen, wie in vitro-Studien weiter auszuwerten.
Die Ex-vivo-Modell impliziert eine breite Palette von möglichen Methoden zur Messung und Analyse der Ergebnisse. Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion kann nach der RNA-Isolierung und cDNA-Synthese durchgeführt werden, um die Genexpression Ebene zu untersuchen, wie durch Niessner et al. 14 gezeigt. Die Immunhistochemie ist ein etabliertes Instrument, um die Protein-Ebene, um die Proteinexpression und die zelluläre Herkunft innerhalb atherosklerotischer Läsionen nachweisen zu evaluieren. Western-Blot verwendet werden, um Signalwege zu analysieren. Außerdem Zellisolation durch Verdauung in einem Enzym-Lösung eröffnet die Gelegenheit, Durchflusszytometrie-Analyse durchzuführen, um weiter zu analysieren, zum Beispiel Zelltyp, Zelltypen und Grad der Aktivierung. Weiterhin wird nach der Zellisolierungspectratyping stellen eine gute Methode, um weiter zu analysieren T-Zell-Rezeptor-Variabilität. Darüber hinaus wurde nach der Verdauung magnetische Zellisolierung ist eine bewährte hochwertige Methode der Zellseparation der spezifische zelluläre Subtypen für weitere in vitro-Studien oder Microarray-Analyse. Endlich können Überstände für die Proteinmessung mittels ELISA gesammelt werden. Im Ergebnis ist die Ex-vivo-Modell ein wertvolles Werkzeug, um die genauen Änderungen in den entzündlichen Milieu, in menschlichen atherosklerotischen Läsionen zu untersuchen.
Die Ex-vivo-Modell basiert auf Endarteriektomie Proben. Verwendung von atherosklerotischen Plaques von verschiedenen Individuen erhalten werden, können in einem größeren Grad an Differentialzellzusammensetzung und damit höhere Variation der Niveaus von Genen / Proteinen von Interesse führen. Daher ist es wichtig, nicht fibrosklerotischer Läsionen 10 lipidreichen oder komplizierten Plaque-Proben zu verwenden, da die Entzündungsreaktion deutlich niedriger in fibrosklerotischer Lesions. Daher ist es von großem Interesse, um die Plaque-Morphologie vor der Analyse der Ergebnisse der Plaque-Kultur-Experimente bewerten.
Darüber hinaus enthält jede Probe Probe verschiedenen Stufen des atherosklerotischen Läsion Entwicklung / Progression von der ersten endothelialen Dysfunktion und Lipidakkumulation Schritt zur Fettstreifen und Entwicklung eines nekrotischen Kerns zu brech Plaques. Somit, um die Heterogenität der Plaquegewebe zu minimieren, ist es erforderlich, die Ränder, die in der Regel frühen Schritte der Atherogenese darstellen geschnitten.
Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass die Schneid induziert Gewebeverletzung Antworten. Aber unsere Plaque Gewebekulturexperimenten zeigten vergleichbare Genexpression der kultivierten Gewebe Plaque nicht-kultivierte Gewebe Plaque. So unterstreicht dies, dass die aktuelle Methode ist ein gutes Werkzeug, um die entzündliche Milieu, in atherosklerotischen Läsionen zu untersuchen.
Die KulturPlaque-Stücke auf einen Zeitraum von bis zu einem Tag begrenzt. Wenn Plaque-Gewebe mehr als einen Tag kultiviert, die Variation der Ergebnisse drastisch erhöht. Darüber hinaus nach 3 Tagen die Plakette Zusammensetzung und Morphologie zusammenbricht.
Es gibt Grenzen, die man im Auge behalten werden müssen, wenn die Anwendung dieses Modells. Die Ex-vivo-Modell ist eine gute Methode, um die entzündliche Milieu, in atherosklerotischen Läsionen zu studieren. Dennoch sind wichtige Komponenten in diesem Zusammenhang fehlt. Keine hämodynamischen Eigenschaften sind zutreffend und systemische Einflüsse sind völlig fehlt. Darüber hinaus ist es mit dieser Methode nur möglich, kurzfristige Änderungen zu untersuchen, aber es fehlt eine langfristige Analyse wegen des Zusammenbruchs der Plaquemorphologie.
Abschließend präsentieren wir hier eine Methode, die nützlich für die Forscher, die sich für die Untersuchung von potentiellen neuen Molekülen auf menschlichen atherosklerotischen Läsion Entzündung sein wird. Die Ex-vivo-Plaque-culture Modell tut leiden unter Unterschiede zwischen dem murinen und humanen Immunsystem, aber es gibt uns die Möglichkeit, die zellulären Zusammenspiel im Rahmen der atherosklerotischen Läsionen zu analysieren und stellen die Möglichkeit, lokale Entzündungskaskaden läsionaler und Wege zu untersuchen. Die hier beschriebene Ex-vivo-Plaque-Kultur-Methode ist einfach zu bedienen und ist reproduzierbar und kann helfen, zur Identifizierung und Validierung neuartiger Krankheitsmechanismen und therapeutische Ziele.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Konflikte offen zu legen.
Acknowledgments
Wir danken Nadine Wambsganss für hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) ER 682/2-1 und ein Forschungsstipendium der Deutschen Gesellschaft für Kardiologie zu C. Erbel, sowie einem Forschungsstipendium des Deutschen Akademischen Service-Heidelberg L. Zhao unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium | Gibco | 21875-091 | |
| FCS | Gibco | 10270-106 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | |
| 15 ml Tube | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Culture dish (60 mm) | Orange Scientific | 5550200 | |
| LPS | Sigma | L4516 | |
| Cell culture plates 48-well | Greiner | 677102 | |
| Scalpel - single use | Feather | FEA200130011 | |
| TissueLyser | Precellys 24 Dual | Cat. No. EQ03119.200.RD010.0 | |
| RNeasy (Mini) Kit | Qiagen | Cat. No. 74104 | |
| Boehringer cDNA kit | Roche Diagnostics | Cat. No. 11483188001 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific |
References
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Hansson, G. K., Libby, P. The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword. Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).
- Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 1262-1275 (2000).
- Erbel, C., et al. Expression of IL-17A in human atherosclerotic lesions is associated with increased inflammation and plaque vulnerability. Basic Res Cardiol. 106, 125-134 (2011).
- Erbel, C., et al. Functional profile of activated dendritic cells in unstable atherosclerotic plaque. Basic Res Cardiol. 102, 123-132 (2007).
- Bentzon, J. F., Falk, E. Atherosclerotic lesions in mouse and man: is it the same disease. Curr Opin Lipidol. 21, 434-440 (2010).
- Tran, D. Q., Ramsey, H., Shevach, E. M. Induction of FOXP3 expression in naive human CD4+FOXP3 T cells by T-cell receptor stimulation is transforming growth factor-beta dependent but does not confer a regulatory phenotype. Blood. 110, 2983-2990 (2007).
- Raes, G., et al. Arginase-1 and Ym1 are markers for murine, but not human, alternatively activated myeloid cells. J Immunol. 174, 6561-6562 (2005).
- Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
- Stary, H. C. Natural history and histological classification of atherosclerotic lesions: an update. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 1177-1178 (2000).
- Galkina, E., Ley, K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis. Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).
- Suganuma, T., Workman, J. L. MAP kinases and histone modification. J Mol Cell Biol. 4, 348-350 (2012).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473, 317-325 (2011).
- Niessner, A., et al. Synergistic proinflammatory effects of the antiviral cytokine interferon-alpha and Toll-like receptor 4 ligands in the atherosclerotic plaque. Circulation. 116, 2043-2052 (2007).
- Monaco, C., et al. Canonical pathway of nuclear factor kappa B activation selectively regulates proinflammatory and prothrombotic responses in human atherosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5634-5639 (2004).
