Un humano<em> Ex Vivo</em> Placa aterosclerótica modelo para estudiar la lesión Biología
Summary
La aterosclerosis es un proceso inflamatorio crónico. Este manuscrito ilustra un fácil utilizar el modelo ex vivo para investigar la carótida fresca o placas de la arteria coronaria. El modelo in vivo ex permite la investigación de sustancias potenciales sobre el medio inflamatorio en las lesiones ateroscleróticas humanas y los resultados pueden ser analizados mediante diversos métodos.
Abstract
La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria crónica de la vasculatura. Hay varios métodos para estudiar el compuesto inflamatoria en las lesiones ateroscleróticas. Los modelos de ratón son una herramienta importante para investigar los procesos inflamatorios en la aterogénesis, pero estos modelos adolecen de las diferencias fenotípicas y funcionales entre el murino y el sistema inmunológico humano. Experimentos in vitro de células se utilizan para evaluar específicamente los cambios de tipo dependiente de células causados por una sustancia de interés, pero las variaciones dependientes de la cultura y la incapacidad para analizar la influencia de moléculas específicas en el contexto del compuesto inflamatoria en las lesiones ateroscleróticas limitar el impacto de los resultados. Además, la medición de los niveles de una molécula de interés en la sangre humana ayuda a investigar más a fondo su relevancia clínica, pero esto representa la inflamación sistémica y no local. Por lo tanto, aquí se describe un modelo de cultivo de la placa para estudiar la biología de la lesión aterosclerótica humanaex vivo. En resumen, las placas frescas se obtuvieron de los pacientes sometidos a endarterectomía o cirugía de revascularización coronaria y se almacenan en un medio RPMI en hielo hasta su uso. Las muestras se cortan en pequeñas piezas seguido de distribución aleatoria en una placa de 48 pocillos, que contiene medio RPMI además de una sustancia de interés, tales como citocinas o quimiocinas solos o en combinación durante determinados períodos de tiempo. Después de la incubación, los pedazos de placa pueden ser de choque congelados para el aislamiento de ARNm, embebidos en parafina o PTU para la tinción inmunohistoquímica o destrozados y zadas por el Western Blot. Además, las células se pueden aislar de la placa para el análisis de citometría de flujo. Además, los sobrenadantes pueden ser recogidos para la medición de proteína por ELISA. En conclusión, el modelo in vivo ex presentado se abre la posibilidad de estudiar más a fondo la biología lesional inflamatoria, que puede dar lugar a la identificación de mecanismos de la enfermedad novela y dianas terapéuticas.
Introduction
La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria crónica es una de las principales causas de muerte en los países industrializados 1-2. Las complicaciones de la ateroesclerosis, síndromes coronarios agudos, especialmente, se han relacionado con la ruptura de las lesiones vulnerables, causando la aterotrombosis y la oclusión del vaso 3. La inmunidad innata y adaptativa parece estar involucrado en todas las etapas de la aterogénesis 2,4-5. Aunque se han logrado avances significativos en el tratamiento del infarto de miocardio, la prevención efectiva de la aterosclerosis y los eventos cardiovasculares adversos están aún sin resolver. Por lo tanto, el estudio de la biología lesional es esencial para aumentar nuestro conocimiento de la fisiopatología de la aterosclerosis y de permitir la identificación de nuevas dianas terapéuticas y el desarrollo de nuevas terapias.
En muchos casos, se utilizan modelos murinos para investigar la fisiopatología de las enfermedades específicas. Sin embargo, el estudio de la aterogénesis utilizando modelos de ratón es accompanied por varias limitaciones: (1) Por lo general, los ratones ateroscleróticos reciben una dieta alta en colesterol. Los niveles de colesterol en estos modelos no se pueden comparar con los de los pacientes con niveles séricos elevados de colesterol 6. (2) Existen diferencias sustanciales entre el murino y el sistema inmunológico humano; por lo tanto Foxp3 es un marcador específico de células T reguladoras murinos, mientras que la expresión de Foxp3 humano en células T humanas no necesariamente confiere un fenotipo regulador 7. También, el paradigma Th1/Th2 tal como se define en los seres humanos no es totalmente transferible a las células T murinas. (3) alternativa (M2) patrones de activación no existe un número de marcadores que se utilizan para identificar los monocitos y macrófagos murinos tales como F4/80 y los marcadores de la clásica (M1) vs en células mieloides humanos 8. (4) La expresión de genes de monocitos de sangre periférica murinos y humanos se ha encontrado para ser sustancialmente diferente 9.
Por lo tanto, con el fin de aumentar nuestra comprensión deprocesos inflamatorios crónicos en la aterosclerosis humana, tenemos que hacer uso de modelos de trabajo con los tejidos humanos, sangre o células. Aquí se describe un modelo de cultivo de tejidos placa humano, lo que permite la investigación de posibles nuevas sustancias en el concepto de la biología lesional inflamatoria humana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí presentamos un modelo in vivo de cultivo ex placa para investigar la influencia de sustancias potencialmente relevantes en la biología de la lesión aterosclerótica. La principal ventaja de este método ex vivo es la capacidad de evaluar la influencia de las sustancias indicadas en las células inflamatorias y su interacción celular, así como las vías inflamatorias y cascadas dentro de lesiones ateroscleróticas humanas. Varios métodos utilizables (por ejemplo, RT-PCR, wes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Nadine Wambsganss por su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG) 682/2-1 ER y un estipendio de investigación de la Sociedad Alemana de Cardiología a C. Erbel, así como un estipendio investigación del alemán Servicio Académico Heidelberg a L. Zhao.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium | Gibco | 21875-091 | n/a |
| FCS | Gibco | 10270-106 | n/a |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | n/a |
| 15 ml tube | Sarstedt | 62,554,502 | n/a |
| culture dish (60mm) | Orange Scientific | 5550200 | n/a |
| LPS | Sigma | L4516 | n/a |
| Cell Culture Plates 48-well | Greiner | 677102 | n/a |
| Scalpel – single use | Feather | FEA200130011 | n/a |
| TissueLyser | Precellys 24 Dual | Cat. No. EQ03119.200.RD010.0 | n/a |
| RNeasy (Mini) Kit | Qiagen | Cat. No. 74104 | n/a |
| Boehringer cDNA kit | Roche Diagnostics | Cat. No. 11483188001 | n/a |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | n/a | |
References
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