En Människa<em> Ex vivo</em> Aterosklerotiska plack modell för att studera Lesion Biologi

Summary

Ateroskleros är en kronisk inflammatorisk process. Detta manuskript illustrerar en lättanvänd ex vivo-modell för att undersöka färsk carotid eller kranskärls plack. Den ex vivo modell möjliggör undersökning av potentiella ämnen på inflammatorisk miljö i humana aterosklerotiska lesioner och resultat kan analyseras med olika förfaranden.

Abstract

Ateroskleros är en kronisk inflammatorisk sjukdom i vaskulaturen. Det finns olika metoder för att studera den inflammatoriska föreningen i aterosklerotiska lesioner. Mus modeller är ett viktigt verktyg för att undersöka inflammatoriska processer i aterogenes, men dessa modeller lider av de fenotypiska och funktionella skillnader mellan mus och människans immunförsvar. In vitro cellförsök används för att specifikt utvärdera celltyp beroende förändringar orsakade av en substans intresse, men kulturberoende variationer och oförmågan att analysera påverkan av specifika molekyler i samband med den inflammatoriska föreningen i aterosklerotiska lesioner begränsa påverkan av resultaten. Dessutom att mäta nivåerna av en molekyl av intresse i humant blod hjälper till att ytterligare undersöka dess kliniska relevans, men detta representerar systemiska och inte lokal inflammation. Därför, här beskriver vi en plakett kulturmodell för att studera människans aterosklerotisk skada biologiex vivo. Kort sagt, färska plack som erhållits från patienter som genomgår endarterectomy eller koronar bypass-kirurgi och lagras i RPMI medium på is tills användning. De provbitar skärs i små bitar följt av slumpmässig fördelning i en 48-brunnar, innehållande RPMI medium i tillägg till en substans av intresse, såsom cytokiner och kemokiner ensamma eller i kombination för angivna tidsperioder. Efter inkubation, kan plack styckena chock frysas för mRNA-isolering, inbäddad i paraffin eller oktober för immunohistokemi färgning eller krossade och lyseras för Western blotting. Vidare kan celler isoleras från plack för flödescytometrianalys. Dessutom kan supernatanter samlas upp för proteinmätning genom ELISA. Sammanfattningsvis öppnar presenterade ex vivo-modell möjlighet att ytterligare studera inflammatoriska lesional biologi, vilket kan leda till identifiering av mekanismer nya sjukdoms och terapeutiska mål.

Introduction

Ateroskleros som en kronisk inflammatorisk sjukdom som är en av huvudorsakerna till dödsfall i industriländerna ^1-2. Komplikationer av åderförkalkning, speciellt akuta koronara syndrom, har kopplats till bristningar i utsatta lesioner, vilket orsakar aterotrombos och kärlocklusion ^3. Medfödd och adaptiv immunitet verkar vara inblandade under alla faser av aterogenes ^2,4-5. Även om betydande framsteg har gjorts i behandlingen av hjärtinfarkt, effektivt förebyggande av åderförkalkning och negativa kardiovaskulära händelser är fortfarande olöst. Således studerar lesional biologi är viktigt för att öka vår kunskap om patofysiologin vid åderförkalkning och att möjliggöra identifiering av nya terapeutiska mål och utveckling av nya behandlingsmetoder.

I många fall används murina modeller använts för att undersöka patofysiologin för specifika sjukdomar. Men studerar aterogenes använda musmodeller är accompanied av flera begränsningar: (1) Vanligtvis aterosklerotiska möss får en hög kolesterol diet. De kolesterolnivåer i dessa modeller kan inte jämföras med dem hos patienter med förhöjda kolesterolserumnivåer ^6. (2) Det finns betydande skillnader mellan murina och humana immunsystemet; alltså foxp3 är en specifik markör för murina regulatoriska T-celler, medan mänsklig foxp3 uttryck i humana T-celler inte nödvändigtvis ger en reglerande fenotyp ^7. Dessutom är Th1/Th2 paradigm såsom definierats i människor inte helt överföras till murina T-celler. (3) Ett antal markörer som används för att identifiera murina monocyter och makrofager såsom F4/80 och markörer för klassisk (M1) vs alternativ (M2) aktiveringsmönster finns inte i humana myeloida celler ^8. (4) Gene expression av murina och humana perifera blodmonocyter har befunnits vara väsentligen annorlunda ^9.

Således, för att öka förståelsen förkroniska inflammatoriska processer i mänsklig åderförkalkning, vi måste använda modeller som arbetar med mänskliga vävnader, blod och celler. Här beskriver vi en modell av mänsklig plack vävnadskultur, vilket möjliggör undersökning av potentiella nya ämnen i begreppet mänsklig inflammatorisk lesional biologi.

Protocol

1. Förbered medel enligt följande Odlingsmedium: RPMI-medium. Lägg 10% fetalt kalvserum (FCS). Addera 100 U / ml penicillin G, och 100 g / ml streptomycin. 2. Förvaring av färsk plack cylinder fram till användning Den halspulsådern endarterectomy operation av patienter med eller utan ischemiska symtom (stroke, övergående ischemisk attack) med en betydande halspulsådern stenos kommer att utföras av kärlkirurger och kranskärls endart…

Representative Results

Här presenterar vi ett antal figurer som visar resultaten av ex vivo plack odling. För att bedöma förändringar i den inflammatoriska miljön som svar på agenten av intresse för ex vivo-modell experiment mäter vi olika molekyler som är kända för att vara primärt involverad i aterogenes. Som representativa pro-atherogenic cytokiner vi väljer TNFa, IL6 och IFNg 2,11. Dessutom använder vi von Willebrand-faktor och vävnadsfaktor för att utvärdera pro-trombotiska ändringar. Dessu…

Discussion

Här presenterar vi ett ex vivo plack kultur modell för att undersöka påverkan av potentiellt relevanta ämnen på aterosklerotisk skada biologi. Den stora fördelen med denna ex vivo-metoden är förmågan att utvärdera inverkan av angivna substanser på inflammatoriska celler och deras cellulära samspel samt inflammatoriska vägar och kaskader i humana aterosklerotiska lesioner. Flera användbara metoder (t.ex. RT-PCR, western blot, immunhistokemi, flödescytometri, ELISA) bidrar till a…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
RPMI medium	Gibco	21875-091	n/a
FCS	Gibco	10270-106	n/a
Penicillin-streptomycin	Sigma	P-4458	n/a
15 ml tube	Sarstedt	62,554,502	n/a
culture dish (60mm)	Orange Scientific	5550200	n/a
LPS	Sigma	L4516	n/a
Cell Culture Plates 48-well	Greiner	677102	n/a
Scalpel – single use	Feather	FEA200130011	n/a
TissueLyser	Precellys 24 Dual	Cat. No. EQ03119.200.RD010.0	n/a
RNeasy (Mini) Kit	Qiagen	Cat. No. 74104	n/a
Boehringer cDNA kit	Roche Diagnostics	Cat. No. 11483188001	n/a
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific		n/a