माइकोबैक्टीरियम लेप्री, कुष्ठ रोग की प्रेरणा का एजेंट, इन विट्रो में नहीं उगते. हम एम. की बड़ी मात्रा का रखरखाव सुनिश्चित करने के लिए एक बैसीलरी निलंबन तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए एक आसान वर्णन आवेदनों की एक किस्म के लिए लेप्री. माउस लुटेरा टीका, व्यवहार्यता का मूल्यांकन, ठंड और विगलन बैसीलरी स्टॉक द्वारा प्रचार के लिए प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णित हैं.
माइकोबैक्टीरियम लेप्री की वजह से कुष्ठ, ब्राजील सहित दुनिया भर के कई देशों में अभी भी स्थानिक है कि एक महत्वपूर्ण संक्रामक रोग है. एम. उगाने के लिए कोई ज्ञात तरीकों वर्तमान में लेप्री में इन विट्रो, प्रयोगशाला में इस रोगज़नक़ के अध्ययन में एक प्रमुख बाधा पेश. इसलिए, एम. के रखरखाव और विकास लेप्री उपभेदों अधिमानतः athymic नग्न चूहों (परमाणु Foxn1 यू) में प्रदर्शन कर रहे हैं. चूहों का उपयोग के लिए प्रयोगशाला परिस्थितियों में आसानी से उपलब्ध है, प्रदर्शन करने के लिए आसान कर रहे हैं, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए मानकीकरण और प्रोटोकॉल के विकास की अनुमति. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित रूप में उपस्थित रिपोर्ट में, हम, न्यूनतम सेल मलबे के साथ और उच्च बैक्टीरियल व्यवहार्यता सूचकांक के साथ एक निलंबन जो पैदावार trypsin, का उपयोग नग्न माउस पैरों के पंजों से बेसिली की शुद्धि के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन. Ziehl-Neelsen द्वारा बैसीलरी गिनती के लिए मानक विधि के लिए एक संशोधनधुंधला और प्रकाश माइक्रोस्कोपी भी प्रदर्शन किया है. इसके अतिरिक्त, हम एम. के रखरखाव और भंडारण के लिए एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल के रूप में ठंड और विगलन बैसीलरी शेयरों के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन लेप्री उपभेदों.
कुष्ठ रोग, माइकोबैक्टीरियम लेप्री के कारण बीमारी, दुनिया 1,2 भर के कई देशों में एक महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्या है. त्वचा और परिधीय तंत्रिकाओं को प्रभावित करता है कि एक संक्रामक रोग के रूप में जाना जा रहा है के बावजूद, रोग की जटिल immunopathogenesis में शामिल तंत्र के बारे में ज्ञान में कई अंतराल वहाँ अब भी कर रहे हैं.
एम. के चुनौतीपूर्ण विशेषताओं के अलावा अपने अध्ययन में बाधा कि लेप्री कृत्रिम संस्कृति मीडिया और अपने अपेक्षाकृत लंबे दुगनी समय (लगभग 14 दिन) 3,4 में विकसित करने के लिए अपनी असमर्थता हैं. एम. उपयोग करने वाले अधिकांश प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं लेप्री कुष्ठ रोगियों की त्वचा के घावों से या ऐसे armadillos और चूहों 5,6 के कई उपभेदों के रूप में प्रयोगात्मक पशु मॉडल, से शुद्ध बेसिली के साथ स्थापित कर रहे हैं.
कई सालों के लिए, शोधकर्ताओं ने एम. के शोधन पर निर्भर है लेप्री multibacillary lepr की त्वचा के घावों सेप्रयोगात्मक प्रक्रियाओं में उपयोग के लिए osy रोगियों. लाइव एम. के इन विट्रो खेती या रखरखाव के लिए कई प्रयोगशाला की स्थिति लेप्री प्रयास किया गया है, लेकिन आज तक, पशु मॉडल अनुसंधान प्रयोजनों के लिए सबसे उपयुक्त साबित हुई है. 1960 के दशक और 1970 के दशक में शोधकर्ताओं ने एम. का पता लगाने और मूल्यांकन के लिए चूहों और armadillos का उपयोग शुरू किया विरोधी एम. के जवाब में बैक्टीरियल वृद्धि निगरानी लेप्री व्यवहार्यता, लेप्री दवाओं, और माइक्रोबैक्टीरियल उपभेदों 2,4 के विकास और रखरखाव में.
पशु मॉडल नैतिक चिंताओं, रखरखाव की लागत, पशु रखरखाव के लिए आवश्यक विशेष बुनियादी ढांचे, और परिणाम के गरीब reproducibility और अंतिम पैदावार सहित, विशेष रूप से armadillos और nonhuman primates में, कुछ सीमाएं हैं. वर्तमान में, चूहों कुष्ठ रोग अनुसंधान के लिए पसंदीदा मॉडल जानवर हैं. चूहों का उपयोग के लिए प्रयोगशाला परिस्थितियों प्रदर्शन करने के लिए आसान, आसानी से उपलब्ध हैं, और मानकीकृत प्रोटोकॉल की अनुमति <sup> 7,8,9. नग्न चूहों एम. के रखरखाव में इस्तेमाल किया गया है यहां तक कि कम व्यवहार्य बैसीलरी भार के साथ, टी सेल की कमी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया विपुल ग्रेन्युलोमा गठन और अच्छा बैसीलरी गुणन की ओर जाता है, क्योंकि लेप्री उपभेदों. इस प्रकार, इस पशु मॉडल कुष्ठ रोग अनुसंधान समुदाय के भीतर व्यापक स्वीकृति प्राप्त की है.
वर्तमान रिपोर्ट में, हम नग्न माउस पैरों के पंजों से बेसिली के enzymatic शुद्धि के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन, एक एम की तैयारी के लिए करना न्यूनतम सेल मलबे के साथ और उच्च बैक्टीरियल व्यवहार्यता सूचकांक के साथ लेप्री निलंबन. व्यवहार्यता तेजी से प्रयोगशाला में किया जा सकता है जो फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी, द्वारा निर्धारित किया जाता है. हम भी ठंड Ziehl-Neelsen धुंधला और प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा बैसीलरी गिनती के लिए मानक विधि के लिए एक संशोधन का प्रदर्शन. इसके अतिरिक्त, हम एम. के रखरखाव और भंडारण के लिए एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल पेश लेप्री उपभेदों की अनुमति ठंड और बैसीलरी सेंट की विगलनocks.
एम. के प्रचार के लिए एक अच्छी तरह से सचित्र, सफल प्रोटोकॉल का एक विस्तृत विवरण लेप्री बहुत जरूरत है. हमारे अध्ययन से छानने का काम और trypsin पाचन द्वारा inoculum तैयारी के प्रोटोकॉल inocula (+ 0 अंक) बहुत कम सेलुलर मलबे के साथ और बेसिली की उच्च व्यवहार्यता के साथ प्राप्त करने की अनुमति देता है कि यह दर्शाता है. सोडियम हाइड्रोक्साइड बेसिली 6 की शुद्धि के लिए ऊतक disaggregate के लिए इस्तेमाल किया गया है. एम. की शुद्धि के लिए सोडियम हाइड्रोक्साइड का उपयोग हमारी प्रयोगशाला में प्रदर्शन अध्ययन लेप्री व्यवहार्यता दृढ़ संकल्प और पशु टीका (नहीं दिखाया डेटा) के लिए निलंबन के homogenization में बाधा, बेसिली के clumps के गठन में हुई.
निस्पंदन और trypsin पाचन द्वारा inoculum तैयारी के साथ सामना करना पड़ा संभावित समस्याओं बैक्टीरियल या फंगल एजेंट के साथ inoculum के सेलुलर मलबे और प्रदूषण की बड़ी राशि शामिल है. मामले में सेलुलर debr की बड़ी मात्रा मेंशोधन के बाद मनाया, या तो trypsin अब सक्रिय नहीं है या जैविक सामग्री का एक अत्यधिक राशि है रहे है. Trypsin शेयर समाधान के enzymatic गतिविधि मूल्यांकन किया जाना चाहिए. प्रारंभिक जैविक सामग्री की अत्यधिक मात्रा में संदिग्ध है, सामग्री aliquots में विभाजित किया जाना चाहिए और प्रोटोकॉल अलग बैचों में बाहर किया जाना चाहिए. बैक्टीरियल या फंगल एजेंट के साथ inoculum के संक्रमण से बचने के लिए, देखभाल सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत सामग्री पर कार्रवाई करने के लिए लिया जाना चाहिए. कवक और / या जीवाणु संक्रमण का पता चला रहे हैं, तो निलंबन खारिज किया जाना चाहिए.
हमारे प्रोटोकॉल की एक सीमा है कि वर्णित अर्द्ध मात्रात्मक पद्धति का उपयोग व्यवहार्यता के मूल्यांकन की आत्मीयता है. प्रकाशित मात्रात्मक विधि 6 से कम सटीक हालांकि अर्द्ध मात्रात्मक आकलन किया व्यवहार्यता, और अधिक व्यावहारिक है. 0 + और 1 की व्यवहार्यता स्कोर प्रचार और ठंड के रखरखाव के लिए संतोषजनक रहे हैंएम. लेप्री. लाहिड़ी एट अल. पहले से ही 80-90% व्यवहार्य inoculum साथ inoculated नग्न चूहों, टीका के 4-5 महीनों में (उच्च व्यवहार्यता बेसिली) कटाई के लिए उपयुक्त पैरों के पंजों में परिणाम दिखाया है. इसलिए, (4 महीने के आसपास) जल्दी संक्रमण सबसे अच्छा कटाई का समय है. जमे हुए inocula की कटाई के लिए, वर्तमान प्रोटोकॉल में चूहों विकास घटता गारंटी करने के लिए लंबी अवधि (7 माह) के लिए टीका बनाए रखा गया. पर्याप्त व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम अधिमानतः मेजबान और प्रसंस्करण से जैविक सामग्री इकट्ठा करने के बाद 24 घंटे के भीतर, ताजा बेसिली निलंबन का इस्तेमाल होता है. इसके अलावा, अभिकर्मकों की गुणवत्ता, हौसले से तैयार पतला trypsin और व्यवहार्यता धुंधला समाधान, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम की गारंटी करने के लिए आवश्यक हैं.
इस प्रोटोकॉल की एक और सीमा है कि अंतिम एम. लेप्री निलंबन मेजबान डीएनए, आरएनए, प्रोटीन, आदि से मुक्त नहीं है. इसलिए, अन्य शुद्धि चरणों टी जोड़ा जाना चाहिएओ एक एम. प्राप्त लेप्री निलंबन मेजबान सेल घटकों से मुक्त.
एम. के पूरे ऊतक नमूनों ठंड से व्यवहार्य बेसिली को बनाए रखने के लिए एक विधि लेप्री घावों 9 सूचित किया गया है. हालांकि, Portaels एट अल द्वारा अध्ययन. ठंड और एम. के विगलन के बाद 65-97% के बीच लेकर व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया उल्लेखनीय कमी, लेप्री Armadillo 9 से प्राप्त ऊतक नमूनों संक्रमित. हमारे प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया है कि एम. में मनाया व्यवहार्यता सूचकांक (तालिका 1) जमे हुए नहीं किया गया था कि विभाज्य की तुलना में जब ठंड और विगलन के बाद लेप्री निलंबन गिरा. दरअसल, एम. ठंड ठंड मीडिया में लेप्री निलंबन लेकर व्यवहार्यता झुकेंगे व्यवहार्यता स्कोर 1 + के साथ 50-70%, व्यवहार्यता स्कोर 0 + unfrozen निलंबन में प्राप्त हुई थी जबकि से. बहरहाल, एम. के गुणन लेप्री (नग्न चूहों की 7 महीने के बाद टीका के बाद संतोषजनक था <sटुनिशिया> 1 टेबल). पुनर्गठन के नमूनों के साथ नग्न चूहों का टीका मतलब 100 बार प्रारंभिक inoculum की तुलना बेसिली की संख्या में वृद्धि हुई 60 दिन के लिए जमे हुए बनाए रखा. ऐसा प्रतीत होता है कि एम. ठंड बजाय संक्रमित ऊतक नमूनों की ठंड मीडिया में लेप्री निलंबन, और अधिक कुशल है. हमारे प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण कदम Colston और हिल्सन 8 द्वारा प्रदर्शन के रूप में बेसिली व्यवहार्य बनाए रखने के लिए आवश्यक एक ठंड कंटेनर में एएफबी की धीमी ठंड, है. भविष्य प्रयोगों अब ठंड की अवधि के बाद बेसिली की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए आयोजित किया जाएगा.
संक्षेप में, क्योंकि एम. लेप्री विट्रो में नहीं उगते, हमारे प्रोटोकॉल व्यवहार्य inoculum के रखरखाव के लिए एक तेज और आसान विकल्प के लिए अनुमति देता है, और सफल ठंड कदम इस प्रकार परिभाषित उपभेदों के एक बैंक की स्थापना को सक्षम करने, पशुओं में निरंतर पारित होने के बिना उपभेदों के रखरखाव संभव बनाता है.
यह खंड इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए अभिकर्मकों तैयार करने के लिए निर्देश शामिल हैं.
1. क्लोम – रस
क्लोम – रस | 0.5 ग्राम |
आसुत जल | अप करने के लिए 100 मिलीलीटर |
बाँझ फ़िल्टर. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
2. 7H9
7H9 शोरबा आधार | 4.7 जी |
40% ग्लिसरॉल स्टॉक | 5 मिलीलीटर |
आसुत जल | अप करने के लिए 900 मिलीलीटर |
क्रियाशीलता, जबकि पानी के साथ आधार मिश्रण तो ग्लिसरॉल जोड़ें. बाँझ 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
3. ब्रेन दिल निषेचन (भी)
BHI | 37 ग्राम |
आसुत जल | अप करने के लिए 1000 मिलीलीटर |
बाँझ 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
4. फिनोल सीरम
4.1) 5% फिनोल
फिनोल | 5 मिलीलीटर |
आसुत जल | अप करने के लिए 100 मिलीलीटर |
4.2) सीरम फिनोल
भ्रूण गोजातीय सीरम | 2 मिलीलीटर |
5% फिनोल | 98 मिलीलीटर |
4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
5. ठंड Ziehl-Neelsen दाग के लिए समाधान
5.1) CarboFuchsin
Fuchsin | 1 ग्राम |
फिनोल क्रिस्टल 60 डिग्री सेल्सियस से इनकार | 5 मिलीलीटर |
शुद्ध एथिल शराब | 10 मिलीलीटर |
आसुत जल | अप करने के लिए 100 मिलीलीटर |
प्रत्येक उपयोग से पहले तक.
5.2) methylene नीले बेस
Methylene नीले | 3 जी |
95% एथिल शराब | अप करने के लिए 200 मिलीलीटर |
5.3) शराब एसिड
70% शराब | 990 मिलीलीटर |
chloridric एसिड | 10 मिलीलीटर |
6. ठंड के लिए मध्यम:
OADC | 10 मिलीलीटर |
ग्लिसरोल | 20 मिलीलीटर |
7H9 मध्यम | अप करने के लिए 100 मिलीलीटर |
उपयोग से पहले ग्लिसरॉल आटोक्लेव और निस्पंदन द्वारा OADC बाँझ.
7. Autoclaved एम. लेप्री निलंबन
20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
The authors have nothing to disclose.
हम तकनीकी सहायता के लिए बिएट्रिज़ जीसी Sartori, Lázara एम. Trino, एना एलिसा Fusaro और क्लाउडिया PM कार्वाल्हो धन्यवाद. हम जानवरों की सुविधा की स्थापना का समर्थन के लिए प्रणव कुमार दास ने धन्यवाद. हम पांडुलिपि में संशोधन के लिए Lais आरआर कोस्टा धन्यवाद. इस अध्ययन Fundação पौलिस्टा कॉन्ट्रा Hanseníase और Pesquisa à Fundação डे Amparo से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया एस्टाडो डी साओ पाउलो (FAPESP 2009/06122-5) करते हैं.
BacLight Bacterial Viability Kit | Invitrogen; Molecular Probes | L7007 | |
Hanks' balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma | H9269 | |
Cryo1°C Freezing Container | Nalgene | 5100001 | |
Lowenstein-Jensen medium | LB Laborclin | 901122 | |
Saline | TEK Nova INC | S5812 | |
Pen | Dako | S2002 | |
Centrifuge tube 50ml/conical base | TPP | 91050 | |
Cell strainer – 40 µm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
Trypsin | Sigma | T-7409 | |
Middlebrook 7H9 Broth Base | Sigma-Aldrich | M0178 Fluka | |
Glycerol | Gibco BRL | 15514011 | |
Brain heart infusion (BHI) | Oxoid LTDA | CM1135 | |
Fuchsin | Merck Millipore | 1159370025 | |
Phenol | Invitrogen | 15509037 | |
Ethyl alcohol | Merck Millipore | EX02764 | |
Cloridric acid | Merck | 1131349010 | |
BBL Middlebrook OADC (oleic acid-albumin-dextrose-catalase) | Becton Dickinson | 211886 | |
Fetal bovine serum | Gibco; LifeTechnologies | 26140079 |