Mycobacterium leprae, de verwekker van lepra, niet groeien in vitro. We beschrijven een eenvoudig te protocol volgen om een bacillaire schorsing voor te bereiden op het onderhoud van grote hoeveelheden M. verzekeren leprae voor verschillende toepassingen. Protocollen voor vermeerdering door muis voetzool inenting, de evaluatie van de levensvatbaarheid, invriezen en ontdooien bacillaire voorraad worden in detail beschreven.
Lepra, veroorzaakt door Mycobacterium leprae, is een belangrijke infectieziekte die nog endemisch is in vele landen over de hele wereld, waaronder Brazilië. Er zijn geen bekende methoden voor het kweken van M. leprae in vitro, de presentatie van een belangrijk obstakel in de studie van deze ziekteverwekker in het laboratorium. Daarom is de handhaving en groei van M. leprae-stammen worden bij voorkeur uitgevoerd in athymische naakt-muizen (NU-Foxn1 nu). De laboratoriumomstandigheden bij muizen zijn direct beschikbaar, gemakkelijk uit te voeren en laat standaardisatie en ontwikkeling van protocollen voor het bereiken van reproduceerbare resultaten. In dit rapport beschrijven we een eenvoudig protocol voor zuivering van bacillen van naakt muis voetzolen met trypsine, die een suspensie met minimale celafval en hoge bacteriële levensvatbaarheid index oplevert, zoals bepaald met fluorescentiemicroscopie. Een wijziging van de standaard methode voor bacillaire tellen door Ziehl-Neelsenvlekken en lichtmicroscopie wordt ook gedemonstreerd. Verder beschrijven we een protocol voor invriezen en ontdooien bacillaire voorraden alternatief protocol voor onderhoud en opslag van M. leprae stammen.
Lepra, een ziekte die wordt veroorzaakt door Mycobacterium leprae, is een belangrijk probleem voor de volksgezondheid in vele landen over de hele wereld 1,2. Ondanks het feit dat bekend staat als een infectieziekte die zowel de huid en perifere zenuwen beïnvloedt, zijn er nog steeds hiaten in kennis over de betrokken bij complexe immunopathogenese van ziektemechanismen.
Onder de uitdagende kenmerken van M. leprae dat haar studie belemmeren zijn het onvermogen om te groeien in kunstmatige voedingsbodems en de relatief lange verdubbeling tijd (ongeveer 14 dagen) 3,4. Meest experimentele procedures die M. gebruiken leprae worden opgezet met bacillen gezuiverd van huidletsels van lepra patiënten of van experimentele diermodellen, zoals gordeldieren en verscheidene stammen van muizen 5,6.
Al vele jaren hebben onderzoekers afhankelijk van zuivering van M. leprae van huidletsels van multibacillaire LepRosy patiënten voor gebruik bij experimentele procedures. Verschillende laboratorium voor de in vitro kweek of onderhouden van levende M. leprae zijn geprobeerd, maar tot op heden, hebben diermodellen bleek het meest geschikt voor onderzoeksdoeleinden worden. In de jaren 1960 en 1970, begonnen de onderzoekers met behulp van muizen en gordeldieren voor de detectie en beoordeling van M. leprae levensvatbaarheid, controle bacteriegroei in reactie op anti-M leprae drugs, en de groei en het onderhoud van mycobacteriële stammen 2,4.
De diermodellen hebben een aantal beperkingen, vooral in gordeldieren en niet-menselijke primaten, waaronder ethische bezwaren, kosten van onderhoud, speciale infrastructuur die nodig is voor het onderhoud van dieren, en een slechte reproduceerbaarheid van de resultaten en de uiteindelijke opbrengsten. Momenteel muizen zijn de voorkeursmodel dier voor lepra onderzoek. De laboratoriumomstandigheden bij muizen zijn direct beschikbaar, gemakkelijk uit te voeren en laat gestandaardiseerde protocollen <sup> 7,8,9. Naakt muizen zijn gebruikt bij het onderhoud van M. leprae stammen omdat, zelfs bij lage levensvatbaar bacillaire belastingen, de T-cel deficiënte immuunrespons leidt tot uitbundige granuloomvorming en goede bacillaire vermenigvuldiging. Zo heeft dit diermodel opgedaan brede acceptatie binnen de melaatsheid onderzoeksgemeenschap.
In dit rapport beschrijven we een eenvoudig protocol voor enzymatische zuivering van bacillen uit naakt muis voetzolen, die bestemd zijn voor de bereiding van een M. leprae ophanging met minimale cel puin en met een hoge bacteriële levensvatbaarheid index. De levensvatbaarheid wordt bepaald door fluorescentie microscopie, die snel kan worden uitgevoerd in het laboratorium. We tonen ook aan een wijziging van de standaard methode voor het bacillaire tellen door koude Ziehl-Neelsen kleuring en lichtmicroscopie. Bovendien presenteren we een alternatief protocol voor onderhoud en opslag van M. leprae stammen, waardoor invriezen en ontdooien van bacillaire stocks.
Een gedetailleerde beschrijving van een goed geïllustreerd succesvol protocol voor propagatie van M. leprae is hard nodig. Onze studie toont aan dat het protocol van inoculum voorbereiding door middel van filtratie en trypsinedigestie laat de inocula worden verkregen met zeer weinig cellulaire puin en met een hoge levensvatbaarheid van bacillen (score 0 +). Natriumhydroxide werd gebruikt om het weefsel voor zuivering van bacillen 6 splitsen. Studies uitgevoerd in ons laboratorium met behulp van natriumhydroxide voor de zuivering van M. leprae resulteerde in de vorming van klompjes bacillen, belemmeren de homogenisering van de suspensie op levensvatbaarheid bepaling en dierlijke inoculatie (gegevens niet getoond).
Mogelijke problemen met het inoculum voorbereiding door filtratie en trypsine digestie onder grote hoeveelheid cellulair afval en verontreiniging van het inoculum met bacteriële of fungale middelen. In het geval van grote hoeveelheden cellulaire Debrwordt waargenomen na zuivering, ofwel de trypsine niet meer actief is of er een overmatige hoeveelheid biologisch materiaal. Enzymatische activiteit van trypsine voorraadoplossing worden geëvalueerd. Als overmatige hoeveelheid eerste biologisch materiaal wordt vermoed, moet het materiaal worden verdeeld in porties en het protocol moet in afzonderlijke partijen worden uitgevoerd. Om verontreiniging van het inoculum met bacteriële of fungale middelen vermijden, moet erop worden gelet dat het materiaal onder aseptische omstandigheden verwerken. Als schimmel-en / of bacteriële besmetting worden geconstateerd, wordt de schorsing moet worden weggegooid.
Een beperking van ons protocol is de subjectiviteit van de levensvatbaarheid evaluatie met behulp van de beschreven semi-kwantitatieve methode. Levensvatbaarheid semi-kwantitatief bepaald is praktischer, hoewel minder nauwkeurig is dan de gepubliceerde kwantitatieve methode 6. Levensvatbaarheid score van 0 + en 1 + bevredigend zijn voor het onderhoud van de vermeerdering en de bevriezing vanM. leprae. Lahiri et al.. hebben reeds aangetoond dat naakt muizen ingeënt met 80-90% haalbaar inoculum, resulteren in voetzolen geschikt voor het oogsten (hoog levensvatbaarheid bacillen) 4-5 maanden van inenting. Daarom vroeg infectie (ongeveer 4 maanden) is de beste oogsttijd. Voor het oogsten van bevroren inocula, werden de muizen in het huidige protocol geïnoculeerde gehandhaafd voor een langere periode (7 maanden) te groeicurves garanderen. Een kritische stap voldoende levensvatbaarheid is het gebruik van verse bacillen suspensies, bij voorkeur binnen 24 uur na afname van biologisch materiaal van de gastheer en verwerking. Bovendien is de kwaliteit van de reagentia, vers bereide verdunde trypsine en levensvatbaarheid kleuring oplossingen zijn nodig om reproduceerbare resultaten te garanderen.
Een andere beperking van dit protocol is dat de uiteindelijke M. leprae schorsing is niet vrij van gastheer-DNA, RNA, eiwitten, enz. Daarom moeten andere zuiveringsstappen worden toegevoegd to het verkrijgen van een M. leprae schorsing vrij van gastheercel componenten.
Een methode voor het behoud van levensvatbare bacillen door bevriezing hele weefselmonsters van M. leprae laesies gerapporteerd 9. De studie van Portaels et al.. toonde significant verlies van levensvatbaarheid, variërend van 65-97% na invriezen en ontdooien van M. leprae besmet weefselmonsters verkregen van gordeldier 9. Het protocol aangetoond dat de levensvatbaarheid index waargenomen in M. leprae suspensies na invriezen en ontdooien gedaald in vergelijking met de hoeveelheid die niet waren ingevroren (tabel 1). Inderdaad, het bevriezen van de M. leprae schorsing in de vrieskou media leverde levensvatbaarheid variërend 50-70%, waarbij de levensvatbaarheid score 1 +, terwijl de levensvatbaarheid score 0 + werd verkregen in de niet-bevroren schorsing. Niettemin, de vermenigvuldiging van M. leprae was bevredigend na 7 maanden na de enting van naakt muizen ( <strong> Tabel 1). De inoculatie van muizen met naakt gereconstitueerde monsters wordt ingevroren gedurende 60 dagen resulteerde in gemiddeld 100 keer verhoogde het aantal bacillen vergelijking met de oorspronkelijke inoculum. Het blijkt dat het bevriezen van de M. leprae suspensie in vriesmedium plaats van geïnfecteerde weefselmonsters, efficiënter. Een kritische stap in ons protocol is de langzame bevriezing van de AFB in een ijskoude container noodzakelijk de bacillen levensvatbaar te houden, zoals aangetoond door Colston en Hilson 8. Toekomstige experimenten zullen worden uitgevoerd om de levensvatbaarheid van bacillen beoordelen na langere tijd bevriezen.
Kortom, omdat M. leprae groeit niet in vitro ons protocol maakt gemakkelijk alternatief voor instandhouding van levensvatbare inoculum en de succesvolle bevriezingsstap maakt de handhaving van stammen zonder permanente passage bij dieren, waardoor de instelling van een bank van gedefinieerde stammen.
Dit gedeelte bevat instructies voor het bereiden van reagentia om dit protocol uit te voeren.
1. Trypsine
Trypsine | 0,5 g |
Gedestilleerd water | tot 100 ml |
Filter steriliseren. Bewaren bij -20 ° C.
2. 7H9
7H9 bouillon base | 4,7 g |
40% glycerol voorraad | 5 ml |
Gedestilleerd water | tot 900 ml |
Meng de basis met water en voeg dan de glycerol onder roeren. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 minuten te steriliseren. Bewaren bij 4 ° C.
3. Brain Heart Infusion (BHI)
BHI | 37 gr |
Gedestilleerd water | tot 1000 ml |
Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 minuten te steriliseren. Bewaren bij 4 ° C.
4. Fenol serum
4.1) 5% fenol
Fenol | 5 ml |
Gedestilleerd water | tot 100 ml |
4.2) Serum fenol
foetaal runderserum | 2 ml |
5% fenol | 98 ml |
Bewaren bij 4 ° C.
5. Oplossingen voor koude Ziehl-Neelsen Stain
5.1) CarboFuchsin
Fuchsin | 1 g |
Fenol kristallen gefuseerd aan 60 ° C | 5 ml |
Zuivere ethylalcohol | 10 ml |
Gedestilleerd water | tot 100 ml |
Filter voor elk gebruik.
5.2) methyleenblauwactieve Base
Methyleenblauwactieve | 3 g |
95% ethylalcohol | tot 200 ml |
5.3) Alcohol zuur
70% alcohol | 990 ml |
chloridric zuur | 10 ml |
6. Medium voor invriezen:
OADC | 10 ml |
Glycerol | 20 ml |
7H9 medium | tot 100 ml |
Autoclaveer glycerol voor gebruik en steriliseer OADC door filtratie.
7. Geautoclaveerde M. leprae schorsing
Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 minuten. Bewaren bij -20 ° C.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Beatriz GC Sartori, Lazara M. Trino, Ana Elisa Fusaro en Claudia PM Carvalho voor de technische bijstand. Wij danken Pranab K. Das voor het ondersteunen van de oprichting van het dier faciliteit. Wij danken Lais RR Costa voor de herziening van het manuscript. Deze studie werd ondersteund door subsidies van Fundação Paulista contra Hanseníase en Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2009/06122-5).
BacLight Bacterial Viability Kit | Invitrogen; Molecular Probes | L7007 | |
Hanks' balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma | H9269 | |
Cryo1°C Freezing Container | Nalgene | 5100001 | |
Lowenstein-Jensen medium | LB Laborclin | 901122 | |
Saline | TEK Nova INC | S5812 | |
Pen | Dako | S2002 | |
Centrifuge tube 50ml/conical base | TPP | 91050 | |
Cell strainer – 40 µm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
Trypsin | Sigma | T-7409 | |
Middlebrook 7H9 Broth Base | Sigma-Aldrich | M0178 Fluka | |
Glycerol | Gibco BRL | 15514011 | |
Brain heart infusion (BHI) | Oxoid LTDA | CM1135 | |
Fuchsin | Merck Millipore | 1159370025 | |
Phenol | Invitrogen | 15509037 | |
Ethyl alcohol | Merck Millipore | EX02764 | |
Cloridric acid | Merck | 1131349010 | |
BBL Middlebrook OADC (oleic acid-albumin-dextrose-catalase) | Becton Dickinson | 211886 | |
Fetal bovine serum | Gibco; LifeTechnologies | 26140079 |