Leprabasill, den forårsaker agent av spedalskhet, ikke vokser in vitro. Vi beskriver en enkel å følge protokollen for å forberede en basillær suspensjon for å sikre opprettholdelse av store mengder av M. leprae for en rekke applikasjoner. Protokoller for formering med musen footpad inokulasjon, evaluering av levedyktighet, frysing og tining basillær lager er beskrevet i detalj.
Spedalskhet, forårsaket av Mycobacterium leprae, er en viktig smittsom sykdom som fortsatt er endemisk i mange land rundt om i verden, blant annet Brasil. Det er for tiden ingen kjente metoder for dyrking M. leprae in vitro, presentere en stor hindring i studiet av dette patogenet i laboratoriet. Derfor, opprettholdelse og vekst av M. leprae stammer fortrinnsvis utført i atymisk nakenmus (NU-Foxn1 nu). Den laboratorieforhold for bruk av mus er lett tilgjengelig, lett å utføre og tillater standardisering og utvikling av protokoller for å oppnå reproduserbare resultater. I den foreliggende rapport beskriver vi en enkel protokoll for rensing av bakterier fra nakne mus footpads ved hjelp av trypsin, noe som gir en suspensjon med et minimum av cellerester og med høy bakteriell levedyktighet indeks, bestemt ved fluorescerende mikroskop. En modifikasjon av standard metode for basillær telling av Ziehl-Neelsenbeising og lys-mikroskopi fremkommer også. I tillegg beskriver vi en protokoll for frysing og tining bacillary aksjer som et alternativ protokoll for vedlikehold og lagring av M. leprae stammer.
Spedalskhet, en sykdom forårsaket av Mycobacterium leprae, er et viktig folkehelseproblem i mange land rundt om i verden 1,2. Til tross for å være kjent som en smittsom sykdom som påvirker både hud og perifere nerver, er det fortsatt flere kunnskapshull om mekanismene som er involvert i den komplekse immunpatogenese av sykdommen.
Blant de utfordrende egenskapene til M. leprae som hindrer dens studien er dens manglende evne til å vokse i kunstig kultur media og dens relativt lang dobling tid (ca 14 dager) 3,4. De fleste eksperimentelle prosedyrer som bruker M. leprae er satt opp med basiller renset fra hudlesjoner av spedalskhet pasienter eller fra eksperimentelle dyremodeller, for eksempel beltedyr og flere stammer av mus 5,6.
I mange år har forskerne avhengig av rensing av M. leprae fra hudlesjoner av multibacillary leprOSY pasienter for anvendelse i eksperimentelle prosedyrer. Mange laboratoriebetingelser for in vitro kultiveringen eller vedlikehold av levende M. leprae har vært forsøkt, men til dags dato, har dyremodeller vist seg å være mest egnet for forskningsformål. I 1960 og 1970 begynte forskere ved hjelp av mus og beltedyr for påvisning og vurdering av M. leprae levedyktighet, overvåking bakteriell vekst som respons på anti-M. leprae narkotika, og i vekst og vedlikehold av mykobakterier stammer 2,4.
De dyremodeller har noen begrensninger, særlig i beltedyr og ikke-menneskelige primater, inkludert etiske spørsmål, kostnadene ved vedlikehold, spesielle infrastruktur som trengs for dyr vedlikehold og dårlig reproduserbarhet av resultater og endelige avkastning. Foreløpig foretrekker datamus modelldyr for spedalskhet forskning. Den laboratorieforhold for bruk av mus er lett tilgjengelig, lett å utføre og tillater standardiserte protokoller <sup> 7,8,9. Nakne mus som har blitt brukt i opprettholdelsen av M. leprae stammer fordi, selv med lave levedyktige bacillary belastninger fører til T-celle-manglende immunrespons mot strømmende dannelse av arrvev og god basillær multiplikasjon. Dermed har denne dyremodell fått bred aksept innenfor det spedalskhet forskningsmiljøet.
I den foreliggende rapport beskriver vi en enkel protokoll for enzymatisk rensing av bakterier fra nakne mus footpads, beregnet for fremstilling av en M. leprae suspensjon med minimal celle rusk og med høy bakteriell overlevelsesindeks. Levedyktigheten er bestemt av fluorescerende mikroskop, som kan bli hurtig gjennomført i laboratoriet. Vi viser også en modifikasjon til standardmetoden for basillær telling av kulde Ziehl-Neelsen flekker og lys mikroskopi. I tillegg presenterer vi en alternativ protokoll for vedlikehold og lagring av M. leprae stammer, slik at frysing og tining av smitteførende stocks.
En detaljert beskrivelse av en godt illustrert vellykket protokoll for forplantning av M. leprae er sterkt nødvendig. Vårt studium viser at protokollen for inokulum preparatet ved filtrering og trypsin fordøyelse tillater inokula som kan oppnås med meget liten cellerester og med høy levedyktighet bacilli (skår 0 +). Natriumhydroksyd har vært brukt til å disaggregate vevet for rensing av bacilli 6.. Studier som er utført i vårt laboratorium ved hjelp av natrium-hydroksyd for rensing av M. leprae, resulterte i dannelse av klumper av bacilli, hindrer homogenisering av suspensjonen for levedyktighet bestemmelse og dyr inokulering (data ikke vist).
Potensielle problemer som oppstår med inokulatet preparatet ved filtrering og trypsin fordøyelse omfatter store mengder celle-debris, og forurensning av inokulum med bakterie-eller soppmidler. I tilfelle av store mengder cellulær Debrer observeres etter rensing, enten trypsin ikke lenger er aktiv, eller det er en overdreven mengde av biologisk materiale. Enzymatisk aktivitet av trypsin-stamløsning må evalueres. Hvis overdreven mengde innledende biologisk materiale man mistenker, bør materialet deles opp i alikvoter og protokollen må utføres i flere omganger. For å unngå forurensning av inokulumet med bakterie-eller soppmidler, må man sørge for å behandle materialet under aseptiske forhold. Hvis sopp-og / eller bakteriell forurensning oppdages suspensjon skal kasseres.
En begrensning av vår protokollen er en subjektiv levedyktighet evaluering ved hjelp av den beskrevne semi-kvantitativ metode. Levedyktighet vurderes semi-kvantitativt er mer praktisk, men mindre nøyaktig enn den publiserte kvantitativ metode 6. Livskraftig score på 0 + og 1 + er tilfredsstillende for vedlikehold av forplantning og frysing avM. leprae. Lahiri et al. har allerede vist at nakne mus inokulert med 80-90% levedyktig pode, resultere i footpads egnet for høsting (høy levedyktighet basiller) på 4-5 måneder med vaksinasjonen. Derfor er tidlig infeksjon (rundt 4 måneder) den beste høsting tid. For høsting av frossen inokulater, ble musene i denne protokoll opprettholdes inokulerte for lengre perioder (7 måneder) for å garantere vekstkurver. Et kritisk trinn for å sikre tilstrekkelig levedyktighet er bruk av friske bacilli suspensjoner, fortrinnsvis innen 24 timer etter oppsamling av biologisk materiale fra verten og prosessering. Videre er kvaliteten av de anvendte reagenser, tilberedes fortynnede trypsin og levedyktighet, fargeløsninger, er nødvendig for å sikre reproduserbare resultater.
En annen begrensning av denne protokollen er at den endelige M. leprae suspensjon er ikke fri for verts DNA, RNA, protein, etc. Derfor må det tilsettes andre rensetrinn to få en M. leprae suspensjon fri for vertscellekomponenter.
En fremgangsmåte for å opprettholde levedyktige bakterier ved frysing hele vevsprøver av M. leprae lesjoner har vært rapportert ni. Imidlertid er undersøkelse av Portaels et al. demonstrert betydelig tap av levedyktighet, og varierer mellom 65-97% etter frysing og tining av M. leprae infisert vevsprøver hentet fra armadillo ni. Vår protokoll viste at overlevelsesindeks observert i M. leprae suspensjoner etter frysing og tining var nede i forhold til den delmengde som ikke hadde vært frosset (tabell 1). Faktisk, frysing M. leprae suspensjon kuldemedier ga levedyktighet alt fra 50-70%, med levedyktighet poengsum 1 +, mens levedyktighet poengsum 0 + ble oppnådd i gassform suspensjon. Likevel, multiplikasjon av M. leprae var tilfredsstillende etter syv måneder etter vaksinasjonen av nakne mus ( <sTrong> Tabell 1). Inokuleringen av nakne mus med rekonstituert prøvene opprettholdt fryst i 60 dager resulterte i gjennomsnittlig 100 ganger økning i antallet av bacilli i forhold til den opprinnelige inokulum. Det ser ut til at frysing av M. leprae suspensjon i frysemediet, i stedet for infiserte vev prøver, er mer effektive. Et kritisk trinn i protokollen er langsom frysing av AFB i et innfrysningskar, som er nødvendig for å opprettholde levedyktige bakterier, som påvist ved Colston og Hilson 8.. Fremtidige eksperimenter vil bli utført for å vurdere levedyktigheten til basiller etter lengre frysing perioder.
I sammendrag, fordi M. leprae ikke vokser in vitro, tillater vår protokoll for en rask og enkelt alternativ for vedlikehold av levedyktige podestoff, og en vellykket frysing trinnet muliggjør opprettholdelse av stammene uten kontinuerlig passasje i dyr, og muliggjør opprettelse av en bank av definerte stammer.
Denne delen inneholder instruksjoner for å forberede reagenser for å utføre denne protokollen.
En. Trypsin
Trypsin | 0,5 g |
Destillert vann | opp til 100 ml |
Filter sterilisere. Oppbevares ved -20 ° C.
2. 7H9
7H9 buljong basen | 4,7 g |
40% glyserol lager | 5 ml |
Destillert vann | opp til 900 ml |
Bland basen med vann og tilsett glycerol under omrøring. Autoklav ved 121 ° C i 20 minutter for å sterilisere. Oppbevar ved 4 ° C.
Tre. Hjerne hjerte infusjon (BHI)
BHI | 37 g |
Destillert vann | opp til 1000 ml |
Autoklav ved 121 ° C i 15 minutter for å sterilisere. Oppbevar ved 4 ° C.
4. Fenol serum
4.1) 5% fenol
Fenol | 5 ml |
Destillert vann | opp til 100 ml |
4.2) Serum fenol
føtalt bovint serum | 2 ml |
5% fenol | 98 ml |
Oppbevar ved 4 ° C.
5. Løsninger for kaldt Ziehl-Neelsen Stain
5.1) CarboFuchsin
Fuchsin | 1 g |
Fenol krystaller smeltet til 60 ° C | 5 ml |
Pure etylalkohol | 10 ml |
Destillert vann | opp til 100 ml |
Filter før hver bruk.
5.2) metylenblått Base
Metylenblått | 3 g |
95% etylalkohol | opp til 200 ml |
5.3) Alkohol syre
70% alkohol | 990 ml |
kloridisk syre | 10 ml |
6. Medium for frysing:
OADC | 10 ml |
Glyserol | 20 ml |
7H9 medium | opp til 100 ml |
Autoklav glyserol før bruk og sterilisere OADC ved filtrering.
7. Autoclaved M. leprae suspensjon
Autoklav ved 121 ° C i 20 min. Oppbevares ved -20 ° C.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Beatriz GC Sartori, Lazara M. Trino, Ana Elisa Fusaro og Claudia PM Carvalho for teknisk assistanse. Vi takker Pranab K. Das for å støtte etableringen av dyret anlegget. Vi takker Lais RR Costa for å revidere manuskriptet. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Fundação Paulista contra Hanseníase og Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2009/06122-5).
BacLight Bacterial Viability Kit | Invitrogen; Molecular Probes | L7007 | |
Hanks' balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma | H9269 | |
Cryo1°C Freezing Container | Nalgene | 5100001 | |
Lowenstein-Jensen medium | LB Laborclin | 901122 | |
Saline | TEK Nova INC | S5812 | |
Pen | Dako | S2002 | |
Centrifuge tube 50ml/conical base | TPP | 91050 | |
Cell strainer – 40 µm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
Trypsin | Sigma | T-7409 | |
Middlebrook 7H9 Broth Base | Sigma-Aldrich | M0178 Fluka | |
Glycerol | Gibco BRL | 15514011 | |
Brain heart infusion (BHI) | Oxoid LTDA | CM1135 | |
Fuchsin | Merck Millipore | 1159370025 | |
Phenol | Invitrogen | 15509037 | |
Ethyl alcohol | Merck Millipore | EX02764 | |
Cloridric acid | Merck | 1131349010 | |
BBL Middlebrook OADC (oleic acid-albumin-dextrose-catalase) | Becton Dickinson | 211886 | |
Fetal bovine serum | Gibco; LifeTechnologies | 26140079 |